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Comment mesurer la croissance bactérienne dans des boîtes de gélose (soit par masse cellulaire, soit par nombre de cellules) ?


Je fais une expérience dans laquelle je grandis S. mutans dans des boîtes de gélose, et je ne sais pas comment je mesurerais la croissance de la S. mutans. Je ne sais pas non plus si je le ferais en mesurant la masse cellulaire ou en comptant les cellules. Des idées?


Le moyen le plus simple consiste à ensemencer les plaques avec une suspension de bactéries en veillant à bien répartir la solution. Ensuite, vous pouvez compter le nombre de colonies, qui serait égal au nombre de cellules individuelles.

Si vous souhaitez mesurer la vitesse de croissance, il est généralement plus simple de mesurer simplement le diamètre des colonies, en vous assurant de toujours ensemencer les plaques avec la même quantité d'inoculum.

Enfin, il est encore plus facile d'estimer la croissance si votre culture est un milieu non liquide et que vous mesurez la densité optique avec un spectrophotomètre.


vous voudrez presque certainement effectuer des dilutions en série de votre suspension et étaler les dilutions en série en utilisant la méthode de la plaque étalée (ou la méthode de la plaque de coulée). Les dilutions permettront de compter beaucoup plus facilement le nombre de bactéries.

Généralement, il n'est pas recommandé de compter plus de 250 colonies sur une plaque pour des raisons de précision (mais je n'en compte jamais plus que 50, car c'est la raison même de faire des dilutions en série). Voici une belle image de ce dont je parle. Il comprend une description de la façon de calculer le nombre d'organismes dans la solution d'origine. Ils ont choisi de compter le nombre de bactéries sur la quatrième plaque (dilution 1:10 000) afin d'estimer le nombre de bactéries dans l'inoculum d'origine. J'espère que cela t'aides]1


11 : Nombres bactériens

De nombreuses études nécessitent la détermination quantitative des populations bactériennes. Les deux méthodes les plus utilisées pour déterminer le nombre de bactéries sont la la norme, ou viable, méthode de comptage des plaques et spectrophotométrique (turbidimétrique) une analyse. Bien que les deux méthodes soient quelque peu similaires dans les résultats qu'elles donnent, il existe des différences distinctes. Par exemple, la méthode de comptage sur plaque standard est une mesure indirecte de la densité cellulaire et révèle des informations liées uniquement aux bactéries vivantes. L'analyse spectrophotométrique est basée sur la turbidité et mesure indirectement toutes les bactéries (biomasse cellulaire), mortes et vivant.

La méthode standard de comptage sur plaque consiste à diluer un échantillon avec une solution saline stérile ou un tampon phosphate jusqu'à ce que les bactéries soient suffisamment diluées pour pouvoir compter avec précision. C'est-à-dire que les plaques finales de la série devraient avoir entre 30 et 300 colonies. Moins de 30 colonies ne sont pas acceptables pour des raisons statistiques (trop peu peuvent ne pas être représentatifs de l'échantillon), et plus de 300 colonies sur une plaque sont susceptibles de produire des colonies trop proches les unes des autres pour être distinguées comme distinctes des unités formant des colonies (UFC). L'hypothèse est que chaque cellule bactérienne viable est séparée de toutes les autres et se développera en une seule colonie discrète (CFU). Ainsi, le nombre de colonies doit donner le nombre de bactéries qui peuvent se développer dans les conditions d'incubation employées. Une large série de dilutions (par exemple, 10 -4 à 10 -10 ) est normalement étalée car le nombre exact de bactéries est généralement inconnu. Une plus grande précision est obtenue en plaquant des doubles ou des triples de chaque dilution, bien que nous ne le fassions pas dans cet exercice.

Une turbidité accrue dans une culture est un autre indice de la croissance bactérienne et du nombre de cellules (biomasse). En utilisant un spectrophotomètre, la quantité de lumière transmise diminue à mesure que la population cellulaire augmente. La lumière transmise est convertie en énergie électrique, ce qui est indiqué sur un galvanomètre. La lecture, appelée absorbance ou densité optique, reflète indirectement le nombre de bactéries. Cette méthode est plus rapide que la numération sur plaque standard mais est limitée car la sensibilité est limitée aux suspensions bactériennes de 10 7 cellules ou plus. La procédure d'utilisation du spectrophotomètre se trouve à la fin de cet exercice.

Pourquoi est-ce E. coli utilisé dans cet exercice? Lorsque vous travaillez avec un grand nombre et un court laps de temps, l'un des micro-organismes les plus fiables est celui qui a été utilisé dans des expériences précédentes, à savoir, Escherichia coli. E. coli a un temps de génération à 37ºC de 20 minutes. Ainsi, il se reproduit très rapidement et est facile à quantifier (c'est-à-dire le nombre (la biomasse) de E. coli les cellules dans une culture bactérienne peuvent être facilement déterminées par spectrophotométrie).


Introduction

Les micro-organismes anaérobies sont répandus dans presque tous les environnements sur Terre. Ce sont des habitants naturels de niches écologiques anaérobies telles que les sédiments aqueux des rivières, des lacs et des océans, les sédiments des sols et le tractus gastro-intestinal des animaux. Leur métabolisme énergétique est adapté à un oxygène moléculaire (O2)-environnement libre. Dans de tels environnements, des conditions limitant le substrat sont souvent rencontrées (Lever et al. 2015). Pour gagner de l'énergie et/ou du carbone, certains anaérobies dégradent la matière organique, par exemple la lignocellulose, les polysaccharides, les protéines ou les lipides. D'autres anaérobies métabolisent les acides gras à chaîne courte, les acides gras volatils (VFA) et les alcools, tandis que certains possèdent également une physiologie rationalisée et efficace pour effectuer une conversion biologique de gaz en produit. Ces processus métaboliques sont connus pour jouer un rôle important dans le cycle global du carbone (Bond et Templeton 2011 Rumpel et Kögel-Knabner 2011 Schmidt et al. 2011 Hatti-Kaul et Mattiasson 2016).

Les substrats pour les procédés de production biotechnologiques sont disponibles dans une large gamme sous forme de solides (par exemple, biomasse, minerai), liquides ou gaz. Les substrats solides sont couramment utilisés dans les usines de biogaz sous forme de cultures énergétiques (par exemple, le maïs) ou de déchets agricoles (Amon et al. 2007 Bond et Templeton 2011). Ces substrats solides peuvent être convertis par un consortium de différents microbes en produits liquides ou gazeux, qui pourraient ensuite être métabolisés en AGV et en gaz (Bond et Templeton 2011).

La biomasse solide est dégradée par une chaîne de processus microbienne, appelée hydrolyse, où les enzymes extracellulaires décomposent les glucides complexes, les protéines et les lipides en leurs constituants de base. Les constituants générés servent de produits pour l'acidogenèse ou l'acétogenèse ainsi que pour l'hydrogène moléculaire (H2) et le dioxyde de carbone (CO2) production. Ces réactions sont soutenues par des bactéries anaérobies facultatives, qui métabolisent l'O résiduel2 dans les digesteurs anaérobies, établissant ainsi des conditions appropriées pour la dernière étape de la chaîne alimentaire anaérobie, qui est appelée méthane biologique (CH4) production médiée par des archées anaérobies obligatoires. Ce procédé, de traitement de matières premières biologiques solides ou de traitement des déchets, aboutit à une production de biogaz contenant environ 50 à 70 % vol. de CH4, 30 à 50 % en volume de CO2, et de petites quantités d'autres gaz, par ex. sulfure d'hydrogène (H2S) (Sasse 1988). La composition finale des gaz d'échappement dépend des substrats appliqués. Le principal produit généré par la digestion anaérobie est le CH4, tandis que le CO2 est considéré comme un sous-produit.

Les substrats liquides utilisés en microbiologie anaérobie et en biotechnologie sont les acides organiques, le glycérol et les sucres. L'un des acides organiques les plus pertinents en biotechnologie est le formiate (Kim et al. 2010 Rittmann et al. 2015a Kottenhahn et al. 2018 Ergal et al. 2018). Le formiate peut être produit à partir de monoxyde de carbone (CO) qui est généré comme sous-produit par le processus de fabrication de Linz-Donawitz (Atwater 1942). Le formate est un substrat très approprié pour H2 production par les archées (Bae et al. 2012, 2015). Le glycérol est considéré comme un substrat important sur le plan biotechnologique en raison du fait qu'il est produit en tant que sous-produit du processus de fabrication du biodiesel. Actuellement, il existe déjà de nombreux bioprocédés qui utilisent le glycérol pour la production d'acide citrique, d'acide lactique, de 1,3-dihydroxyacétone (DHA), de 1,3-propanediol (1,3-PD), de dichloro-2-propanol (DCP), acroléine, H2, éthanol, etc. (Fan et al. 2010). De plus, les sucres peuvent être utilisés comme substrat pour la production microbienne d'acétone-butanol-éthanol (Friedl et al. 1991 Kujawska et al. 2015) ou de H microbien2 production (Rittmann et Herwig 2012 Rittmann et al. 2015a Reischl et al. 2018a Ergal et al. 2018). Un autre procédé anaérobie bien établi qui utilise des cultures pures est le procédé d'oxydation anaérobie de l'ammonium (ANAMOX) (Innerebner et al. 2007, Ali et Okabe 2015). Dans le procédé ANAMMOX, l'ammonium et le nitrite sont proportionnés à l'azote moléculaire (N2). Ce procédé a déjà atteint une échelle commerciale.

CO, H2, CO2, et CH4 sont des substrats ou produits gazeux utilisables respectivement en microbiologie anaérobie et en biotechnologie par des microorganismes carboxydotrophes, hydrogénotrophes, autotrophes ou méthanotrophes. Cependant, jusqu'à présent, aucune culture pure d'un microorganisme méthanotrophe anaérobie n'a été isolée. Croissance microbienne anaérobie sur, par exemple, CO ou H2/CO2 l'utilisation d'une culture pure de micro-organismes dans un processus de conversion biologique de gaz en gaz est bien connue (Bae et al. 2012 Rittmann et al. 2015b). Ces processus sont exécutés efficacement avec des archées et même très compétitifs par rapport aux processus chimiques de conversion de gaz en gaz (Bernacchi et al. 2014a, 2014b). Une caractéristique de ces processus est que même le CO sous-produit2 du processus de digestion anaérobie peut être amélioré en CH4 par un CO ex situ2-à base de production biologique de méthane (CO2-BMP) pouvant être réalisé avec des méthanogènes (Seifert et al. 2013 Rittmann 2015 Rittmann et al. 2015a, b Rachbauer et al. 2016). De plus, il a été montré que le CO2 les émissions des gaz de combustion peuvent être converties en CH4 par Methanothermobacter marburgensis (Seifert et al. 2013). Le CO2-La technologie BMP pourrait également être intégrée dans divers autres CO2 scénarios d'utilisation où les processus de conversion biologique de gaz en gaz pourraient être utilisés (Martínez-Porqueras et al. 2012 Rachbauer et al. 2016 Abdel Azim et al. 2017). Les procédés de conversion biologique de gaz en gaz mentionnés ci-dessus ont déjà atteint l'échelle d'une usine commerciale.

Pour évaluer le rôle des micro-organismes anaérobies dans des conditions de croissance naturelles et pour pouvoir étudier leurs capacités métaboliques et leur potentiel physiologique, la culture est incontournable. Entre autres, la culture de microbes permet d'étudier les réponses physiologiques (Valentine et al. 1994), le métabolisme (Ghose et al. 1978) et l'interaction avec des partenaires syntrophiques potentiels (Shen et al. 2016). Selon l'organisme d'intérêt, différents micro- et macro-nutriments pour soutenir et améliorer la croissance et/ou la formation de produits sont nécessaires. Par conséquent, il est d'un grand intérêt d'augmenter la quantité de cellules viables dans une population et/ou d'optimiser les conditions de culture pour atteindre des productivités et/ou des rendements élevés.

Cette revue donne un aperçu des méthodes hors ligne, en ligne et en ligne qui sont actuellement appliquées en microbiologie anaérobie et en biotechnologie pour la quantification de la production solide (par exemple, biomasse), liquide et gazeuse. Dans la première partie de l'examen, les techniques de culture anaérobie pour la création d'une atmosphère anoxique pour la culture des anaérobies ainsi que les récipients de culture appropriés et les méthodes d'échantillonnage seront discutés. La deuxième partie de la revue présentera des techniques qui peuvent être utilisées pour surveiller ou quantifier la croissance microbienne, l'activité de la population, l'absorption de substrat(s) et la cinétique de formation de produit(s) dans des systèmes microbiens anaérobies constitués de co-cultures microbiennes pures ou définies. Enfin, l'applicabilité de ces méthodes est discutée d'un point de vue écologique à un point de vue technologique sur les bioprocédés avec un accent particulier, mais sans s'y limiter, sur les cultures anaérobies et axéniques (Fig. 1).

Aperçu de la revue suivante, résumant les sujets importants (culture anaérobie, échantillonnage de la biomasse, concentration et viabilité de la biomasse, identification et quantification des substrats et produits liquides et gazeux)


Qu'est-ce qui peut pousser sur une plaque de gélose nutritive ?

Bactéries

Chaque colonie circulaire distincte doit représenter une cellule ou un groupe bactérien individuel qui s'est divisé à plusieurs reprises. Étant conservées au même endroit, les cellules résultantes se sont accumulées pour former une tache visible. La plupart des colonies bactériennes apparaissent de couleur blanche, crème ou jaune et de forme assez circulaire.

Bacillus subtilis(3)
Proteus vulgaris(4)
Staphylococcus aures(5)
Streptococcus pyogenes(6)

Levures

La levure, un type de champignon (pluriel pour champignon), se trouve dans de nombreux endroits de la nature, aux laboratoires de recherche et même dans les cuisines de tous les jours pour la cuisson. Les colonies de levures ressemblent généralement aux colonies bactériennes. Certaines espèces, telles que Candidose, peut se développer sous forme de taches blanches avec une surface brillante.

Candida albicans) est un type de levure qui peut se développer à la surface de la peau(7)
Colonies de levures rondes(8)
Colonies de levures roses(9)

Moules

Les moisissures sont en fait des champignons, et elles apparaissent souvent gris blanchâtre, avec des bords flous. Ils se transforment généralement en une couleur différente, du centre vers l'extérieur. Deux exemples de moules sont présentés ci-dessous :

Moisissure verte (Trichoderma harzianum)(10)
Moisissure noire (Aspergillus nidulaus)(11)

Autres champignons

Des colonies vert mousse, un nuage blanc ou un anneau de spores peuvent être attribués à la croissance de Aspergillus, ce qui est courant dans des infections fongiques telles que le pied d'athlète. Voici un exemple de ce que Aspergillus ressemble à:


Comment mesurer la croissance bactérienne dans les boîtes de Pétri

Les bactéries sont cultivées dans des boîtes de Pétri sur un milieu solide appelé gélose bactérienne, où se forment des colonies circulaires surélevées. Contrairement à une cellule bactérienne individuelle, une colonie est un groupe de bactéries suffisamment grand pour être visible à l'œil nu. La croissance bactérienne peut être mesurée par une simple observation du nombre de colonies présentes. Cependant, des méthodes plus quantitatives incluent l'utilisation d'une chambre de comptage ou, plus souvent, des comptages sur plaques viables. Ce dernier est utilisé le plus fréquemment car il fournit également des informations qualitatives telles que l'effet de conditions de croissance variables. Puisqu'il peut y avoir des milliards de bactéries dans une boîte de Pétri, la mesure nécessite d'abord de diluer l'échantillon pour pouvoir compter le nombre de colonies.

Dans un tube à essai, ajouter 10 microlitres de la culture bactérienne de départ à 90 microlitres de milieu de dilution. Fermer hermétiquement le couvercle du tube et vortexer doucement pour obtenir un mélange homogène. Maintenant, l'échantillon est un dixième de sa concentration d'origine.

Transférer 10 microlitres de ce nouvel échantillon dans un nouveau tube à essai contenant 90 microlitres de milieu de dilution, mélanger à nouveau. Encore une fois, le résultat sera l'échantillon encore plus dilué - il sera maintenant au centième de sa concentration d'origine. Répétez cette opération plusieurs fois, jusqu'à ce que l'échantillon d'origine ait été dilué entre 10 4 et 10 10 fois. Assurez-vous que chaque tube est étiqueté avec la dilution correcte, par exemple 10 -1 , 10 -2 et ainsi de suite.

Déposer 10 microlitres de la dernière dilution complétée sur la plaque de gélose. À l'aide du bord d'étalement, répartissez la solution bactérienne sur toute la surface de la plaque de gélose. Répétez cette opération pour deux autres assiettes. Il est également courant d'effectuer ces étapes avec d'autres niveaux de dilution à des fins de comparaison. Assurez-vous d'étiqueter le fond des assiettes. Remettez les couvercles sur chaque plaque et laissez sécher les plaques de gélose pendant plusieurs minutes soit sur une paillasse de laboratoire sous une flamme, soit dans un incubateur. Placer les plaques dans l'incubateur qui doit être réglé à la température appropriée pour la souche de bactéries. Laisser pousser 12 à 16 heures.

Les colonies devraient être visibles après 16 heures, cependant, certaines modifications génétiques peuvent nécessiter plus de temps (par exemple, le développement de la couleur). Lorsque des colonies sont observables, retirez les plaques et trouvez celles qui ont entre 30 et 300 colonies. À l'aide d'un marqueur permanent, placez un point au fond de la boîte de Pétri - le côté avec la gélose, pas le couvercle - partout où une colonie est visible à travers la gélose. Comptez chaque point du marqueur. Répétez pour chaque plat.

Pour mesurer la quantité de bactéries dans la culture de départ pour cette expérience, la dilution doit être inversée dans les calculs, à deux endroits. Premièrement, lorsque vous avez pris un microlitre du tube à essai pour le mettre dans la boîte de Pétri, vous avez pris un dixième de l'échantillon dilué, vous devez donc tout multiplier par 10 pour inverser cela. De plus, si le facteur de dilution dans le tube à essai était, par exemple, de 10 -7 , alors le nombre de colonies doit être multiplié par 10 7 afin d'inverser l'effet de dilution. Supprimez simplement le signe négatif de l'exposant dans les calculs. Utilisez la formule :

[Nombre de colonies comptées] × 10 × [combien de fois l'échantillon doit être multiplié pour atteindre la concentration d'origine : par exemple, 10 5 ] = Nombre d'unités formant colonie (UFC) par millilitre de culture de départ. C'est la croissance bactérienne dans vos boîtes de Pétri.

Choses dont vous aurez besoin

  • Milieu de dilution
  • Pipettes et pointes
  • Tubes
  • Milieux de culture bactérienne et plaques de gélose
  • Vortex
  • bec Bunsen
  • Épandeurs de verre
  • 70 pour cent d'éthanol

Assurez-vous de stériliser l'épandeur en verre en trempant le bord d'épandage dans de l'éthanol à 70 pour cent et en l'insérant dans une flamme de bec Bunsen. Laissez l'éthanol prendre feu et brûlez lentement l'alcool, ce qui tuera toute contamination bactérienne. Touchez-le doucement à la partie sèche (c'est-à-dire sans bactéries) de la gélose pour la refroidir - la gélose ne doit pas fondre au contact.

Mises en garde

Traitez toute bactérie comme si elle était potentiellement pathogène et utilisez les procédures de sécurité de laboratoire appropriées.


Résumé

Ces dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour la recherche et le développement de nouveaux agents antimicrobiens de diverses sources pour lutter contre la résistance microbienne. Par conséquent, une plus grande attention a été accordée aux méthodes de dépistage et d'évaluation de l'activité antimicrobienne. Plusieurs essais biologiques tels que la diffusion sur disque, la diffusion dans les puits et la dilution en bouillon ou en gélose sont bien connus et couramment utilisés, mais d'autres, tels que les méthodes de cytofluorométrie en flux et de bioluminescence, ne sont pas largement utilisés car ils nécessitent un équipement spécifié et une évaluation plus poussée pour la reproductibilité et la normalisation, même si ils peuvent fournir des résultats rapides sur les effets des agents antimicrobiens et une meilleure compréhension de leur impact sur la viabilité et les dommages cellulaires infligés au micro-organisme testé. Dans cet article de synthèse, une liste exhaustive des in vitro Des méthodes d'essai de sensibilité aux antimicrobiens et des informations détaillées sur leurs avantages et leurs limites sont présentées.


FONDAMENTAUX DE LA MICROBIOLOGIE

Dans le comptage microscopique direct, une chambre de comptage constituée d'une lame réglée et d'une lamelle est utilisée. Il est construit de telle manière que la lamelle, la lame et les lignes réglées délimitent un volume connu. Le nombre de bactéries dans un petit volume connu est directement compté au microscope et le nombre de bactéries dans l'échantillon original plus grand est déterminé par extrapolation.

La chambre de comptage Petroff-Hausser (couramment utilisée dans l'industrie laitière) par exemple, (Figure 16. 1) a de petits carrés gravés 1/20 de millimètre (mm) par 1/20 de mm et fait 1/50 de mm Profond. Le volume d'un petit carré est donc 1/20 000 de mm cube ou 1/20 000 000 de centimètre cube (cc). Il y a 16 petits carrés dans les grands carrés à double ligne qui sont réellement comptés, ce qui fait le volume d'un grand carré à double ligne 1/1 250 000 cc. La procédure normale consiste à compter le nombre de bactéries dans cinq grands carrés à double ligne et à diviser par cinq pour obtenir le nombre moyen de bactéries par grand carré. Ce nombre est ensuite multiplié par 1 250 000 puisque le carré contient un volume de 1/1 250 000 cc, pour trouver le nombre total d'organismes par cc dans l'échantillon d'origine. Si les bactéries sont diluées, par exemple en mélangeant les bactéries avec du colorant avant d'être placées dans la chambre de comptage, alors cette dilution doit également être prise en compte dans les calculs finaux.

La formule utilisée pour le comptage microscopique direct est

Le nombre de bactéries par cc = Le nombre moyen de bactéries par grand carré à double ligne X Le facteur de dilution du grand carré (1 250 000) X Le facteur de dilution de toute dilution effectuée avant de placer l'échantillon dans la chambre de comptage, p.


16.2.2 Dénombrement électronique des cellules

Un compteur Coulter (Fig.16.2) est un appareil pour compter et dimensionner les particules et les cellules. Il est utilisé, par exemple, pour les bactéries et les distributions granulométriques de la qualité de l'air. Le compteur détecte le changement de conductance électrique d'une petite ouverture lorsque du fluide contenant des cellules est aspiré. Les cellules, étant des particules non conductrices, modifient la section efficace du canal conducteur.

C'était un inventeur américain nommé Wallace H. Coulter qui était responsable de la théorie et de la conception du compteur Coulter. Il a d'abord conçu la théorie derrière son fonctionnement en 1947 tout en expérimentant avec l'électronique. Coulter a déterminé que la charge électrique pouvait être utilisée pour déterminer la taille et le nombre de particules microscopiques dans une solution. Ce phénomène est maintenant connu sous le nom de Principe Coulter. Un compteur Coulter typique possède un ou plusieurs microcanaux qui séparent deux chambres contenant des solutions d'électrolyte. Lorsqu'une particule s'écoule à travers l'un des microcanaux, il en résulte un changement de résistance électrique du microcanal rempli de liquide. Ce changement de résistance peut être enregistré sous forme d'impulsions de courant électrique ou de tension, qui peuvent être corrélées à la taille, la mobilité, la charge de surface et la concentration des particules.


Normalement, l'échantillon bactérien est dilué par des facteurs de 10 et étalé sur gélose soit par la technique de la plaque de coulée, soit de la plaque d'étalement. Après incubation, le nombre de colonies sur une plaque de dilution montrant entre 30 et 300 colonies (Fig. 16.4 et Fig. 16.5) est déterminé. Une plaque comportant 30 à 300 colonies est choisie car cette plage est considérée comme statistiquement significative. S'il y a moins de 30 colonies sur la plaque, de petites erreurs dans la technique de dilution ou la présence de quelques contaminants auront un effet drastique sur le décompte final. De même, s'il y a plus de 300 colonies sur la plaque, il y aura un mauvais isolement et les colonies auront grandi ensemble.


Fig 16.4 Techniques de la plaque de coulée et de la plaque d'étalement


Fig.16.5 Méthodes de la plaque de coulée et de la plaque d'étalement

  • Seules les cellules vivantes développent des colonies qui sont comptées
  • Des amas ou des chaînes de cellules se développent en une seule colonie
  • Les colonies ne se développent qu'à partir des organismes pour lesquels les conditions de culture sont propices à la croissance.

Tableau 16.1 Comparaison des différentes méthodes de mesure de la croissance bactérienne

16.2.4 Méthode de comptage des filtres à membrane


Fig. 16.6 Méthode de filtration membranaire


16.2.5 Méthodes de mesure de la turbidité

Lorsque les bactéries se développant dans un milieu liquide sont mélangées, la culture apparaît trouble. En effet, une culture bactérienne agit comme une suspension colloïdale qui bloque et réfléchit la lumière traversant la culture. Dans certaines limites, la lumière absorbée par la suspension bactérienne sera directement proportionnelle à la concentration de cellules dans la culture. En mesurant la quantité de lumière absorbée par une suspension bactérienne, on peut estimer et comparer le nombre de bactéries présentes. L'instrument utilisé pour mesurer la turbidité est un spectrophotomètre (Fig. 16.8). Il se compose d'une source lumineuse, d'un filtre qui ne laisse passer qu'une seule longueur d'onde de lumière, du tube d'échantillon contenant la suspension bactérienne et d'une cellule photoélectrique qui compare la quantité de lumière traversant le tube avec la lumière totale entrant dans le tube. La capacité de la culture à bloquer la lumière peut être exprimée en pourcentage de lumière transmise à travers le tube ou en quantité de lumière absorbée dans le tube. Le pourcentage de lumière transmise est inversement proportionnel à la concentration bactérienne. L'absorbance (ou densité optique) est directement proportionnelle à la concentration cellulaire.


Fig. 16.8 Mesure de la turbidité à l'aide d'un spectrophotomètre

  • Plusieurs dilutions peuvent être réalisées à partir d'un stock bactérien.
  • Un compteur Petroff-Hausser peut ensuite être utilisé pour effectuer un comptage microscopique direct sur chaque dilution.
  • Ensuite, un spectrophotomètre peut être utilisé pour mesurer l'absorbance de chaque tube de dilution.
  • Une courbe standard comparant l'absorbance au nombre de bactéries peut être réalisée en traçant l'absorbance en fonction du nombre de bactéries par cc.
  • Une fois la courbe standard terminée, tout tube de dilution de cet organisme peut être placé dans un spectrophotomètre et son absorbance lue. Une fois l'absorbance déterminée, la courbe standard peut être utilisée pour déterminer le nombre correspondant de bactéries par cc.

16.2.6 Détermination de la teneur en azote

16.2.7 Détermination du poids sec

Il est également possible de suivre l'évolution de la quantité d'un composant cellulaire au lieu de la masse entière de la cellule. Cette méthode peut être choisie parce que la détermination des poids secs est difficile ou lorsque le poids total de la cellule ne donne pas une image précise du nombre d'individus dans une population. Dans ce cas, un seul composant de la cellule est suivi tel que la protéine totale ou l'ADN total. Cela présente certains des mêmes avantages et inconvénients énumérés ci-dessus pour le poids sec. De plus, la mesure d'un composant cellulaire est plus laborieuse que les méthodes mentionnées précédemment car le composant d'intérêt doit être partiellement purifié puis soumis à une analyse conçue pour mesurer la molécule souhaitée. L'hypothèse dans le choix d'un seul composant tel que l'ADN est que ce composant sera relativement constant par cellule. Cette hypothèse pose un problème lorsque les taux de croissance sont différents car les cellules qui se développent à des taux élevés ont en fait plus d'ADN par cellule en raison des initiations multiples de réplication.

La croissance bactérienne peut être indirectement estimée en détectant des changements spécifiques provoqués dans le milieu de croissance à la suite de l'activité et de la multiplication des cellules bactériennes. Il comprend la détection des produits cellulaires d'activité tels que la production d'acide et de gaz. Les tests de réduction de colorant tels que les tests de réduction de bleu de méthylène et de résazurine sont basés sur le fait que la couleur conférée au lait par l'ajout d'un colorant tel que le bleu de méthylène disparaîtra plus ou moins rapidement. L'élimination de l'oxygène du lait et la formation de substances réductrices au cours du métabolisme bactérien font disparaître la couleur. Les organismes responsables de la consommation d'oxygène sont les bactéries. Bien que certaines espèces de bactéries aient considérablement plus d'influence que d'autres, il est généralement admis que plus le nombre de bactéries dans le lait est élevé, plus l'oxygène sera consommé rapidement et, à son tour, plus tôt la couleur disparaîtra. Ainsi, le temps de réduction est considéré comme une mesure du nombre d'organismes dans le lait bien qu'en réalité il soit probable qu'il s'agisse plus véritablement d'une mesure des réactions métaboliques totales se déroulant à la surface cellulaire des bactéries. La production de gaz par les bactéries est une autre activité majeure qui peut être considérée comme un indice de croissance bactérienne. La détection de la production de gaz à l'aide d'un tube Durham et le changement de couleur du milieu de croissance en raison de la réduction des ingrédients sensibles au pH présents dans le milieu sont couramment utilisés pour la détection des coliformes et des levures producteurs d'acide et de gaz. Un appareil pour mesurer le CO2 la production est représentée dans (Fig.16.9)


Remerciements

H.T. et B.J.B. ont été soutenus par l'Australian Research Council Discovery Project DP160102644 (attribué à B.J.B. et S.G.O.). V.J., J.M.G. et J.F.S. ont été soutenus par l'Australian Research Council Discovery Project DP130103547 (attribué à V.J. et S.G.O.). À. a été soutenu par le programme de formation à la recherche du ministère de l'Éducation et de la Formation et par une bourse d'études complémentaire en mathématiques appliquées A. F. Pillow. J.E.F.G. a été soutenu par un prix ARC Discovery Early Career Researcher Award DE130100031. E.L.T. a été soutenu par une bourse d'études supérieures d'Adélaïde ainsi que par une bourse et un financement de projet de Wine Australia (GWR Ph1305). S.B. a été soutenu par l'Australian Research Council Future Fellowship Grant FT130100484. Ce travail a été soutenu par des ressources de calcul intensif fournies par le service Phoenix High Performance Computing de l'Université d'Adélaïde.


Comment mesurer la croissance bactérienne dans des boîtes de gélose (soit par masse cellulaire, soit par nombre de cellules) ? - La biologie

Toutes les méthodes ci-dessus nécessitent soit la disponibilité d'équipements coûteux, soit un investissement de temps substantiel. En réalité, la méthode la plus souvent utilisée surveille simplement la densité optique de l'échantillon. L'absorbance de l'échantillon mesurée dans un spectrophotomètre est corrélée soit au poids sec, soit au nombre de cellules par volume.

La concentration de biomasse est l'une des mesures les plus nécessaires dans les études de fermentation. C'est aussi l'un des plus difficiles et peu fiables. Par exemple, toutes les méthodes de poids sec/humide ci-dessus et tout l'équipement de comptage automatisé échouent complètement si le bouillon contient d'autres matières particulaires insolubles, ce qui est souvent le cas dans un fermenteur pratique. De même, la mesure de la densité optique n'a qu'une utilité limitée si le bouillon de fermentation n'est pas limpide. De plus, ces méthodes ne permettent pas de distinguer les cellules viables des cellules mortes. D'autre part, la numération sur plaque standard peut détecter des cellules viables parmi d'autres matières particulaires. Cependant, la méthode nécessite des préparations élaborées, et il faut 24 à 48 heures pour que les cellules soient incubées et comptées, le coût des boîtes de Pétri et des milieux peut également être prohibitif. Par conséquent, le comptage direct sur plaque est inutile dans le contrôle par rétroaction d'un processus de fermentation, il est principalement utilisé industriellement pour contre-vérifier d'autres mesures, en particulier la densité optique.

Dans cette expérience, la densité cellulaire d'un échantillon donné sera mesurée avec les cinq méthodes suivantes : poids humide, poids sec, densité optique, comptage cellulaire direct avec une chambre et dilutions successives suivies d'un placage.


Stérilisez en utilisant l'une des méthodes décrites sur la page Stériliser les liquides.

L'un des avantages des milieux riches en sel est que les microbes contaminants typiques ne s'y développent pas, de sorte que les milieux avec une concentration en sel d'au moins 10 % peuvent être stérilisés par ébullition.

Assurez-vous que la gélose se dissout complètement. Dans les milieux contenant 15 % ou plus de sel, la gélose peut être lente à se dissoudre. Le support peut sembler trouble ou vous pouvez voir de petits objets translucides comme des lentilles flotter dedans. Continuez à faire bouillir jusqu'à ce que le milieu soit complètement clair, cela peut prendre plus de 15 minutes. Une gélose incomplètement dissoute laissera votre support spongieux ou fragile.


Voir la vidéo: Bakterid inimkehas. Eesti Tervishoiu Muuseum (Janvier 2022).