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Conversion de la densité optique en cfu / ml

Conversion de la densité optique en cfu / ml


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J'ai du mal à comprendre la corrélation entre les mesures de DO et les UFC/ml. Quel est le facteur de conversion entre les deux unités, et ce facteur de conversion compense-t-il d'une manière ou d'une autre les cellules mortes que l'OD pourrait lire ? (Disons également que l'OD est réglé sur la norme 600 nm).


La mesure de la densité optique est la quantité de cellules vivantes et non vivantes dans un échantillon. L'unité formant colonie ne mesure que les cellules viables dans un échantillon. Une DO 600 nm équivaut à environ 8 x 10^8 CFU/ml. Cependant, ce n'est qu'une approximation et ne peut pas pleinement prendre en compte les cellules mortes que l'OD peut lire, cela dépend également du micro-organisme recherché. Une courbe standard peut être calculée à partir de données, mais il est assez difficile d'obtenir un résultat exact. Un article très utile sur la corrélation entre les deux mesures peut être trouvé ici (du Brazilian Journal of Microbiology).


DO et cfu/ml - (13 février 2009 )

J'ai toujours du mal à ajuster la DO pour obtenir certains cfu/ml. Y'a-t'il un quelconque moyen d'y arriver?

Quelle est la corrélation entre OD et CFU ? densité optique aux particules seulement étalonnage bij

Nrelo le 13 février 2009, 04ᚳ AM a dit :

Si je me souviens bien, la relation entre la DO et la CFU est que la DO mesure les cellules vivantes ainsi que les cellules mortes (densité optique de la solution qui comprend les débris cellulaires) alors que la CFU concerne les organismes qui peuvent se développer sur des plaques de gélose (la partie qui est vivante dans votre solution). Je ne sais pas s'il existe un moyen de dire si vous avez un certain OD que vous obtiendrez un nombre connexe de CFU. peut-être lorsque vous prenez la mesure dans la phase logarithmique où elles se développent joyeusement et où il n'y a pas trop de cellules mortes.

TRÈS grossièrement, 1 OD est 1e9 cellules/ml

phage434 le 13 février 2009, 11 & 5844 AM a dit :

ouais c'est la valeur la plus fréquente dont j'ai entendu parler

calibrez votre courbe en fonction du micro-organisme que vous étudiez et contrôlez les conditions d'application (même à la même DO , cfu/ml d'une suspension au réfrigérateur pendant une semaine ne sera pas la même qu'une culture fraîche.

GeorgeWolff le 14 février 2009, 05ᚿ AM a dit :

Lorsque nous faisons des infections, nous préparons le milieu d'infection, l'inoculum ou ce que vous utilisez pour infecter.
De cette façon, vous pouvez vérifier si votre DO et le bact/ml (1 OD est d'environ 1e9 bact/ml) sont des bactéries vivantes/mortes et vous saurez le CFU exact que vous avez utilisé pour infecter.

exactement, nous avions l'habitude de le faire de cette façon aussi. et c'est différent pour chaque bogue, la plupart des approximations que vous voyez seront basées sur E coli. vous pouvez faire quelques validations pour votre bogue, pour vous faire une idée, mais il est toujours sage de plaquer à chaque fois et d'infecter avec des dilutions pour être certain.


Technologie des neuropeptides

F.M. Laurent-Huck , J.M. Felix , in Methods in Neurosciences , 1991

Utilisation de la courbe d'étalonnage

La DO moyenne est mesurée sur chaque standard et définie dans la mémoire de l'ordinateur. La surface mesurée n'est pas critique car la DO moyenne est calculée par unité de surface. Pour compenser de légères variations dans la distribution du matériel radiomarqué, il est préférable de mesurer la DO sur la zone standard presque complète.

En raison des relations non linéaires entre la radioactivité et la réponse du film, diverses transformations mathématiques peuvent être utilisées pour l'étalonnage. Avec 35 S ?? rayonnements et ?? -Max Hyperfilms, la relation entre la DO et la radioactivité peut être considérée comme linéaire (r 0,98) entre 0,05 et 0,5 unité de DO (Fig. 8). Les transformations polynomiales du second ordre montrent souvent de bonnes corrélations (r ≥ 0,99) entre 0,05 et 0,8 unités OD ( Fig. 8 ). Une transformation, telle que log(conc) = F [log(OD)], est une autre possibilité qui peut être testée. Quelle que soit la courbe choisie, pour des résultats précis, des valeurs de DO inférieures à 0,01 (seuil de sensibilité du film voisin et/ou limite de détection de l'analyseur d'images) et des valeurs de DO supérieures à 0,8 unité (approche de la saturation du film,

1 unité OD pour ?? -Max Hyperfilms) doit être évité. La réexposition des sections pendant une durée plus courte ou plus longue devrait entraîner des lectures de DO plus appropriées. Les données totales ou non spécifiques des régions d'intérêt sur les coupes expérimentales sont ensuite calculées par l'ordinateur à partir de la courbe étalon.

8 . Courbes d'étalonnage, illustrant une relation polynomiale (a) et linéaire (b) entre la densité optique et la radioactivité.


La loi Beer-Lambert et OD600

La loi de Lambert-Beer, également connue sous le nom de loi de Beer, relie empiriquement l'absorption de la lumière aux propriétés de l'échantillon. Cette loi stipule qu'il existe une relation logarithmique entre la transmission de la lumière à travers un échantillon spécifique (T = I/Io avec I = lumière sortante et Io = lumière entrante), le coefficient d'extinction molaire pour un composé spécifique (ε), la concentration de l'espèce absorbante dans le matériau (c) et la distance parcourue par la lumière (d).

Les estimations de DO sont devenues synonymes d'estimations de concentration bactérienne (C) ou de nombre (N), selon la loi de Beer-Lambert. Or les mesures de DO sont en fait des mesures de turbidité, on peut donc appliquer la loi de Beer-Lambert, avec certaines considérations, uniquement pour les colonies microbiennes de faibles densités.


Estimation robuste du nombre de cellules bactériennes à partir de la densité optique

La densité optique (DO) est une mesure rapide, bon marché et à haut débit largement utilisée pour estimer la densité des cellules en culture liquide. Ces mesures, cependant, ne peuvent pas être comparées entre les instruments sans protocole d'étalonnage standardisé et sont difficiles à relier au nombre réel de cellules. Nous comblons ces lacunes avec une étude interlaboratoire comparant trois protocoles d'étalonnage de DO, appliqués à huit souches de E. coli conçu pour exprimer constitutivement différents niveaux de GFP. Ces trois protocoles (comparaison avec de la silice colloïdale (LUDOX), dilution en série de microsphères de silice et dosage d'unités formatrices de colonies (UFC) de référence) sont tous simples, peu coûteux et très accessibles. Sur la base des résultats produits par les 244 équipes complétant cette étude interlaboratoire, nous recommandons d'étalonner la DO à l'aide d'une dilution en série de microsphères de silice, qui produit facilement un étalonnage très précis (95,5% des équipes ayant des résidus inférieurs à 1,2 fois), est facilement évalué pour la qualité contrôle et, comme effet secondaire, évalue également la plage linéaire efficace d'un instrument. De plus, les estimations du nombre de cellules à partir de microsphères de silice peuvent être combinées avec un étalonnage de fluorescence contre la fluorescéine pour obtenir des unités de molécules de fluorescéine équivalentes (MEFL), permettant une comparaison directe et une fusion de données avec des mesures de cytométrie en flux calibrées de manière équivalente : dans notre étude, les mesures de fluorescence par cellule n'ont montré qu'une différence moyenne de 1,07 fois entre le lecteur de plaque et les données de cytométrie en flux.


Mesures OD600 : Conseils pour la mise en œuvre

La mesure de la densité optique à 600 nm est une méthode simple et largement utilisée pour suivre la croissance des micro-organismes en culture liquide et pour déterminer leur nombre de cellules.

Source de l'image : Shutterstock : 1094575550

Bien que simple, cette technologie ne doit pas être sous-estimée. Une culture de micro-organismes constitue une suspension, de sorte que la lumière est principalement diffusée plutôt qu'absorbée pendant le processus de mesure photométrique. La diffusion de la lumière est principalement influencée par la forme et la taille de l'organisme ainsi que par la conception du photomètre [1, 2]. Cela signifie qu'un nombre de cellules, ou biomasse, ne peut pas être calculé directement à partir des valeurs de DO (densité optique) mesurées. Une telle conversion nécessite un étalonnage préalable du photomètre avec la souche cultivée, ce qui implique la génération d'une courbe étalon [2].

La courbe standard peut être basée sur différents paramètres, selon le facteur pertinent pour l'expérience en cours. Si, par exemple, l'augmentation de la biomasse d'une culture est intéressante, les densités optiques obtenues à partir des différentes dilutions d'une culture peuvent être reportées sur le poids sec déterminé pour ces échantillons. Cette méthode est également bien adaptée pour la détermination de la plage linéaire de l'échantillon dans ce photomètre spécifique. La relation linéaire entre OD600 et la concentration est très limitée dans le cas des mesures de lumière diffusée par rapport aux mesures d'absorbance, car des densités plus élevées conduisent à une diffusion multiple parmi les particules. Cet effet augmentera la probabilité qu'une plus grande quantité de lumière atteigne éventuellement le détecteur. La courbe standard résultante montrera jusqu'à quelle densité optique les valeurs suivent une progression linéaire.

S'il est crucial de déterminer le nombre de cellules vivantes dans une culture, la DO600 peut être tracé en fonction du nombre de cellules vivantes (les cellules mortes et les débris cellulaires contribuent également à la diffusion de la lumière). À cette fin, des échantillons sont retirés de la culture liquide à plusieurs moments. Une partie est mesurée à 600 nm à l'aide d'un photomètre, tandis que l'autre partie de l'échantillon est soumise à une dilution en série. Un volume défini de chaque dilution est ensuite étalé sur une plaque de gélose séparée et incubé. Le nombre de colonies cultivées sur les plaques est compté, et les unités formant colonie (cfu)/mL ou le nombre de cellules de la culture d'origine peuvent être calculés en conséquence (figure 1). Si les valeurs sont tracées en fonction de la concentration, une courbe d'étalonnage en résultera qui servira de base pour les mesures ultérieures de la même souche en utilisant le même instrument.

Les points suivants doivent être pris en compte lors de la mesure de la DO600: Puisqu'une culture constitue une suspension, l'homogénéité de l'échantillon est critique. Pour cette raison, la culture doit être bien mélangée avant le prélèvement des échantillons et, le cas échéant, le mélange doit être répété juste avant la mesure. Le même milieu de culture frais qui est utilisé pour la culture doit servir de blanc. Si, toutefois, une plus grande précision est requise et si le milieu change de couleur au cours de l'incubation, il peut être avantageux d'utiliser le surnageant de culture comme blanc. Si la densité optique mesurée dépasse la plage linéaire, l'échantillon doit être dilué en conséquence à l'aide du milieu de culture. D'autres causes possibles de variations des valeurs mesurées sont répertoriées dans le Livre blanc 27 [3].


Fichier S1.

Figure A. Résultats de l'analyse de macrorestriction de 17 B. bronchiseptique isolats utilisant Salmonelle Marqueur Typhimurium LT2 et endonucléase de restriction XbaI. Figure B. Mesure de la densité optique (DO) de B. bronchiseptique souche de référence DSM 10303 dans quatre milieux moyens de trois expériences indépendantes. Figure C. Densité optique (DO) de B. bronchiseptique souche type DSM 13414 dans quatre milieux, moyenne de trois expériences indépendantes. Figure D. Densité optique (DO) de B. bronchiseptique isolat de terrain Bb5/12 dans quatre milieux, moyenne de trois expériences indépendantes. Figure E. Densité optique (DO) de B. bronchiseptique isolat de terrain Bb24/12 dans quatre milieux, moyenne de trois expériences indépendantes. Fig. F. Nombre (Log cfu/ml) de bactéries (B. bronchiseptique souche de référence DSM 10303) dans quatre milieux moyens de trois expériences indépendantes. Fig. G. Nombre (Log cfu/ml) de bactéries (B. bronchiseptique souche de type DSM 13414) dans quatre milieux moyenne de trois expériences indépendantes. Figure H. Nombre (Log cfu/ml) de bactéries (B. bronchiseptique isolat de terrain Bb5/12) dans la moyenne de quatre milieux de trois expériences indépendantes. Figure I. Nombre (Log cfu/ml) de bactéries (B. bronchiseptique isolat de terrain Bb24/12) dans la moyenne de quatre milieux de trois expériences indépendantes.

Fichier S2.

Tableau A. Valeurs MIC de 10 B. bronchiseptique isolats, 20 agents antimicrobiens et deux temps d'incubation en cinq répétitions.


Tableau de transmission à absorbance

L'absorbance et la transmittance sont des mesures utilisées en spectrophotométrie. La spectrophotométrie mesure la quantité d'énergie radiante qu'une substance absorbe à différentes longueurs d'onde de la lumière. La technique est utile pour déterminer l'identité d'une substance inconnue et, à l'aide d'un ensemble de normes, déterminer la concentration d'une substance dans un échantillon.

Une table de transmission à absorbance permet une conversion rapide des valeurs de transmission en absorbance en laboratoire ou sur le terrain.


Résumé

Cette étude visait à étudier l'effet de différentes températures de croissance sur la résistance des Escherichia coli O157:H7 et Salmonelle Typhimurium à l'irradiation aux rayons X de basse énergie. L'irradiation d'une solution saline tamponnée au phosphate contaminée avec des rayons X de 0,6 kGy a diminué le nombre de E. coli O157:H7 cultivé à 37 °C jusqu'en dessous de la limite de détection (<1.0 unité formant colonie (UFC)/mL) et ceux de E. coli O157:H7 cultivé à 25 et 15 °C par 4,82 et 4,45 log UFC/mL, respectivement. Les comptes viables de S. Typhimurium cultivé à 37, 25 et 15 °C dans une solution saline tamponnée au phosphate a diminué de 3,56, 3,08 et 2,75 log UFC/mL, respectivement, après irradiation avec des rayons X de 0,6 kGy. L'irradiation de laitues contaminées avec 0,4 kGy a diminué le nombre de E. coli O157:H7 cultivé à 37, 25 et 15 °C par 3,97, 3,45 et 3,10 log UFC/cm 2 , respectivement, et ceux de S. Typhimurium de 4,41, 3,84 et 3,40 log UFC/cm 2 , respectivement. La température de croissance a influencé la résistance des agents pathogènes à l'irradiation aux rayons X en modulant l'intégrité de la membrane cellulaire et de l'ADN, l'activité enzymatique intracellulaire et la fonction de la pompe à efflux. Les résultats de cette étude suggèrent que le statut de résistance au stress des bactéries pathogènes cultivées à différentes températures de croissance devrait être pris en compte pour l'application de l'irradiation aux rayons X pour la stérilisation des produits frais.


Conversion de la densité optique en cfu/ml - Biologie

La mesure de l'absorbance ne nous dit cependant pas combien de cellules sont réellement vivantes dans la culture.

Un moyen simple de compter le nombre de cellules vivantes est d'exploiter leur capacité à se reproduire. Sur une boîte de Pétri recouverte de gélose, chaque cellule viable se divisera à plusieurs reprises, mais sa descendance restera en grande partie immobilisée - elle formera une colonie.

Les cellules de cette colonie sont un clone de la cellule d'origine qui a atterri à la surface de la gélose.

En comptant les colonies, on obtient une estimation directe de la concentration de bactéries viables ou plus précisément du nombre de des unités formant des colonies - UFC par ml dans la culture d'origine.

Pour déterminer le nombre de CFU par ml (CFU/ml) dans une culture, un petit échantillon ou aliquote de volume connu est retiré de la culture et dilué dans un volume connu de milieu stérile.

Une fois dilué par une quantité connue, on peut mesurer le nombre d'UFC dans un volume connu de la solution diluée.

Pour ce faire, nous étalons une partie aliquote de la culture diluée, généralement entre 10 et 200 µL, uniformément sur la surface d'une plaque de Pétri LB-agar.

Lorsqu'elles sont incubées à 37 °C, les bactéries individuelles se développeront pour former des colonies facilement visibles dans les 18 à 24 heures.

Faire des dilutions est l'un des problèmes conceptuels les plus difficiles que rencontrent les étudiants !
Merci de bien réfléchir à ce que vous faites ! besoin d'un rafraîchissement ? lis ça

Connaissez-vous la différence entre un ml et un µL ?
Que signifie une dilution 10 -3 ? Comment en installeriez-vous un.

Si trop de bactéries sont étalées sur un plat, les colonies se développent ensemble pour former un continu pelouse .

Les concentrations bactériennes peuvent être très élevées c'est pourquoi il est généralement nécessaire de mettre en place un série de dilutions .

Pour ce faire, prélevez un aliquot de votre première dilution et diluez-le à nouveau, puis répétez le processus.

Cela nous permet de couvrir une large gamme de concentrations.

Ce processus est illustré ici

Il est difficile, fastidieux et inexact de compter plus de

300 colonies par plaque, vous pouvez vous le prouver si vous le souhaitez.

Dans le même temps, compter trop peu de colonies entraîne une augmentation des imprécisions dues aux erreurs d'échantillonnage.

Vous devez déterminer le CFU/ml dans la culture d'origine, dans une large mesure pour prouver que vous comprenez comment faire des dilutions.

Si vous étalez trop ou trop peu de cellules, vous pouvez répéter le processus d'étalement, sans avoir à configurer une nouvelle série de dilutions

Savez-vous comment passer de CFU par plaque à CFU par ml dans la culture d'origine ?

Quel était le titre de votre culture ?
Imprimez/enregistrez une copie de votre vDatapad qui montre que vous avez obtenu le bon numéro.


Voir la vidéo: Tiheys (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Stod

    Bravo, la phrase est venue juste au fait

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