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Que se passe-t-il lorsque la conductance d'un canal sodium augmente ?


Mon intuition est que, puisque la concentration de sodium dans une cellule est supérieure à la concentration extracellulaire, lorsque la conductance augmente, cela correspond à l'ouverture du canal et signifie que le sodium va entrer dans la cellule. Est-ce correct? Et quel impact cela aura-t-il sur le potentiel membranaire ?


Non, pas tout à fait. Vous êtes sur la bonne voie, mais vous vous trompez en pensant que la concentration en sodium intracellulaire est plus élevée.

Lors de la phase de repos d'un neurone, il y a moins de sodium à l'intérieur de la cellule et plus de sodium à l'extérieur de la cellule. Une pompe ATPase sodium potassium pompe en permanence 3 ions sodium à l'extérieur de la cellule pour 2 cellules potassium qui pénètrent dans la cellule.

Pour que les canaux sodiques voltage-dépendants s'ouvrent, il doit y avoir un changement significatif de tension, qui peut être déclenché par la liaison du neurotransmetteur aux récepteurs par exemple. Cela déclenche l'ouverture des canaux sodium et le sodium va inonder la cellule en raison d'un gradient de concentration élevé (car il y a plus de sodium à l'extérieur qu'à l'intérieur) mais aussi en raison d'un gradient électrique (le neurone est plus négatif à l'intérieur ; les ions sodium positifs vont être attiré vers l'intérieur).

Comme le sodium afflue dans la cellule, le potentiel membranaire deviendra plus positif (dépolarisé) et finira par atteindre un potentiel d'action (30 mV). Après un potentiel d'action, les canaux seront désactivés et fermés. Après une période d'hyperpolarisation, le neurone reviendra à un état de repos.

Source : https://en.wikipedia.org/wiki/Action_potential


La recherche sur la palourde jette un nouvel éclairage sur la marée rouge

La scientifique marine de l'Université du Maine, Laurie Connell, n'est pas du genre à se vanter : elle préfère parler du potentiel de ses recherches actuelles que de la popularité de ce qu'elle a publié dans le passé. Avec plus de cinq mois au sommet des palmarès de la revue scientifique très respectée Nature, cependant, la discussion sur son "papier de palourde" est presque inévitable.

"J'ai été choqué d'apprendre que le journal était si populaire. Il a eu plus de 60 000 téléchargements depuis novembre, et il continue toujours", a déclaré Connell avec enthousiasme. "Je ne sais pas ce qui l'a rendu si populaire, mais il a un très large attrait."

Le rapport de Connell, La mutation des canaux sodiques entraîne une résistance à la saxitoxine chez les palourdes augmente le risque de PSP, était l'aboutissement de plus de huit ans de recherches intensives menées par une équipe internationale de scientifiques visant à mieux comprendre un composé notoire et potentiellement mortel connu sous le nom de saxitoxine. . La saxitoxine est le principal coupable dans les cas d'empoisonnement paralysant des mollusques, ou PSP, la conséquence toujours dangereuse et parfois mortelle du phénomène côtier connu sous le nom de marée rouge.

Les filtreurs comme les palourdes accumulent de la saxitoxine dans leurs tissus lorsqu'ils mangent des algues qui transportent le poison, transmettant une dose concentrée à leurs prédateurs mammifères. La première recherche à examiner de manière approfondie les effets de la saxitoxine sur les palourdes, Connell et son équipe, y compris la chercheuse à la retraite de l'UMaine Betty Twarog, ont découvert que les mollusques souffrent de bon nombre des mêmes symptômes que les victimes humaines de la PSP.

Eh bien, au moins certains d'entre eux le font.

Connell a découvert que toutes les palourdes ne sont pas créées égales lorsqu'il s'agit de combattre les effets de la PSP, et a commencé à percer un mystère microscopique qui parle de la nature même du système nerveux lui-même.

Grâce à une mutation de leur code génétique, les palourdes résistantes à la marée rouge ont pu survivre et se reproduire malgré la présence de saxitoxine, devenant finalement la souche dominante dans les populations de palourdes fréquemment exposées à la marée rouge.

En fait, Connell et son équipe de spécialistes ont découvert que les palourdes mutantes étaient plus de 1000 fois plus résistantes aux effets de la marée rouge que leurs frères non mutés, une découverte surprenante qui a des implications importantes à la fois dans la gestion des palourdes et la recherche médicale.

En raison de son pouvoir sur l'influx nerveux, la saxitoxine a été largement utilisée par les chercheurs médicaux pour étudier la fonction du système nerveux et ses maladies associées. L'approche globale de Connell ouvre de nouvelles portes à la recherche future en reliant la fonction des canaux sodiques à des sites de contrôle spécifiques dans l'ADN de l'organisme.

La découverte que certaines populations de palourdes étaient génétiquement beaucoup plus résistantes à l'empoisonnement par la marée rouge que d'autres pourrait ouvrir de nouvelles voies pour la gestion de la pêche de la mye.

"La capacité des populations individuelles à résister aux effets de la saxitoxine pourrait être utilisée pour déterminer combien de temps les lits de palourdes devraient rester fermés après une marée rouge", a déclaré Connell. « Les palourdes génétiquement résistantes sont capables de continuer à se nourrir beaucoup plus longtemps, accumulant plus de toxines dans leurs tissus, ce qui prend plus de temps à se purger. La connaissance de la sensibilité génétique des palourdes à la marée rouge pourrait aider les gestionnaires à prendre de meilleures décisions sur les palourdes à utiliser dans les programmes d'ensemencement, comment longtemps pour fermer les bancs de palourdes, et d'autres problèmes. »

Les implications du projet ne s'arrêtent pas là. Les découvertes de Connell ont intéressé les écologistes marins, les responsables de la santé publique, les bio-ingénieurs, les pêcheurs : la liste s'allonge encore et encore. L'importance de la recherche dans un si large éventail de disciplines témoigne certainement de sa popularité dans Nature.

Source de l'histoire :

Matériel fourni par Université du Maine. Remarque : Le contenu peut être modifié pour le style et la longueur.


Résumé de l'auteur

Les potentiels d'action sont des ondes électriques qui se propagent à travers de longs axones et sont au cœur de la communication neuronale. Les informations qu'ils véhiculent sont codées dans leur timing précis, une caractéristique essentielle pour l'apprentissage, la mémoire et le contrôle moteur. Ce timing doit être maintenu même si les axones sont exposés à diverses influences extérieures au cours de leur long voyage vers d'autres zones cérébrales et muscles périphériques. Nous avons étudié comment trois types d'axones qui présentent des propriétés morphologiques et physiologiques distinctes, mais interagissent dans un seul comportement sensible au temps, réagissent aux changements de température ambiante. En combinant l'imagerie, l'électrophysiologie et la modélisation, nous déterminons les mécanismes qui permettent aux axones de maintenir la synchronisation du potentiel d'action. Nous montrons que la quasi-insensibilité à la température des vitesses de potentiel d'action prend en charge une synchronisation résistante à la température sur de longues distances, mais que cela ne nécessite pas que les propriétés sous-jacentes du canal ionique soient insensibles à la température. En effet, les propriétés des canaux ioniques pourraient varier considérablement dans leurs réponses en température tant que deux paramètres du canal sodium - la constante de temps de la grille d'activation et la conductance maximale - étaient coordonnés. Ainsi, même les canaux ioniques sensibles à la température prennent en charge la synchronisation du potentiel d'action résistant à la température.

Citation: DeMaegd ML, Stein W (2020) Les modèles d'activité résistants à la température découlent des propriétés coordonnées des canaux sodiques axonaux. PLoS Comput Biol 16(7) : e1008057. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1008057

Éditeur: Joseph Ayers, Northeastern University, ÉTATS-UNIS

A reçu: 14 novembre 2019 Accepté: 15 juin 2020 Publié : 27 juillet 2020

Droits d'auteur: © 2020 DeMaegd, Stein. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous les termes de la Creative Commons Attribution License, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'auteur original et la source soient crédités.

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes se trouvent dans le manuscrit et ses fichiers d'informations à l'appui. Tous les fichiers modèles sont disponibles dans la base de données ModelDB (numéro d'accès 260972).

Le financement: Ce travail a été soutenu par un financement de NSF 1755098 à WS. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Intérêts concurrents : Les auteurs ont déclaré qu'ils n'existaient pas de conflit d'intérêts.


MÉTHODES

Électrophysiologie ovocytaire

Oocytes exprimant Na de ratV1.2 ont été préparés et la tension à deux électrodes a été bloquée essentiellement comme décrit précédemment (Fiedler et al. 2008 Zhang et al. 2007). Les ovocytes ont été récoltés sur Xénope grenouilles, suivant un protocole approuvé par l'Institutional Animal Care and Use Committee de l'Université de l'Utah qui est conforme aux National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Brièvement, les ovocytes ont été baignés dans des courants de ND96 et de sodium (jeN / A) ont été enregistrés en maintenant le potentiel de membrane à � mV et en passant à � mV pendant 50 ms toutes les 20 s. Les ovocytes ont été exposés à la toxine dans un petit bain statique (30 μl) pour conserver le matériel. Les enregistrements ont été effectués à température ambiante (�ଌ).

Toxines

Les μ-Conopeptides ont été synthétisés comme décrit précédemment (Zhang et al. 2007). Le TTX a été obtenu auprès d'Alomone Labs (Jérusalem, Israël), le STX de Calbiochem (San Diego, CA) ou du Conseil national de recherches Canada (Halifax, Nouvelle-Écosse, Canada) et le GTX2/3 du Conseil national de recherches Canada. Dans des expériences impliquant des concentrations élevées, STX et GTX2/3 ont été lyophilisés puis dissous dans ND96. Tous les stocks ont été stockés à �ଌ dans un congélateur sans givre jusqu'à utilisation.

L'analyse des données

Constantes hors taux (kdésactivé valeurs) ont été déterminées à partir d'ajustements exponentiels simples du pic jeN / A après lavage des toxines constantes de vitesse observées (kobs valeurs) ont été obtenues par des ajustements exponentiels simples de jeN / A suivant l'ajout de toxine et les constantes de vitesse (kau valeurs) ont été obtenues à partir des pentes de kobs versus [toxine], comme indiqué précédemment (West et al. 2002). Dans des cas particuliers (voir le texte qui suit immédiatement), l'évolution dans le temps de la récupération des jeN / A après le lessivage de la toxine était biphasique et la récupération était ajustée à une courbe double exponentielle comme indiqué précédemment (Zhang et al. 2009).

Simulation numérique du schéma réactionnel de la figure 1C

Pour modéliser les changements en fonction du temps dans les concentrations des divers composants, le schéma réactionnel de la Fig. 1C a été simulé par réitération des formules suivantes dans une boucle for en utilisant le langage de programmation graphique LabVIEW (National Instruments, Austin, TX)

On a supposé une cinétique de pseudo-premier ordre, c'est-à-dire la concentration d'alcaloïde, notée [$] (représentant STX, GTX2/3 ou TTX), et celui de μ-conopeptide, noté [P], resté constant. Lorsque les concentrations étaient exprimées en micromoles (μM) et le temps en minutes, un incrément de temps Δt de 10 𢄤 s'est avéré suffisamment petit pour tenir compte des concentrations et des constantes de vitesse utilisées pour les simulations utilisées dans cette étude. Les constantes de vitesse sont comme indiqué sur la Fig. 1C et leurs valeurs ont été obtenues en mesurant la cinétique de blocage et de récupération de jeN / A après exposition et lavage à l'alcaloïde et au peptide, chacun seul ou en combinaison, comme suit : kRA et kRA où le kau et kdésactivé valeurs, respectivement, de la réaction de NaV avec peptide seul kBR et kRB où le kau et kdésactivé valeurs, respectivement, de la réaction de NaV avec alcaloïde seul et kCA a été déterminé à partir du kau valeur pour le bloc de courant résiduel du peptide·NaV complexe à saturer [peptide]. Il n'y avait aucun moyen direct de déterminer kCalifornie, mais sa valeur pourrait être calculée, puisque le produit des constantes de vitesse pour les quatre pas dans le sens des aiguilles d'une montre est égal à celui des quatre pas dans le sens inverse des aiguilles d'une montre, c'est-à-dire kCalifornie = [kRA*kCA*kCB*kBR]/[kRB*kavant JC*kRA]. Quand tous les NaV a été converti en un complexe ternaire à l'aide de concentrations saturantes de toxines, l'évolution dans le temps de la récupération fonctionnelle après l'élimination des toxines pourrait être ajustée par une courbe exponentielle unique avec une constante de vitesse kdésactivé, qui était plus petit que kBR (et plus grand que kRA), indiquant que kCB était un chaulage pendant le lavage de la toxine donc kCB pourrait être approximé par kdésactivé. Une valeur plus précise de kCB pourrait être estimée à partir des valeurs déterminées expérimentalement pour six des constantes de vitesse, kRA, kRA, kCA, kRB, kBR, et kavant JC (voir le paragraphe suivant pour la détermination expérimentale de kavant JC), et en calculant le septième, kCalifornie, comme décrit précédemment, tandis que la valeur de kCB a été modifiée jusqu'à ce que l'erreur quadratique moyenne entre les périodes de temps simulées et expérimentales de récupération du bloc atteigne un minimum. Valeurs de kCalifornie et kCB déterminés de cette façon sont présentés dans le tableau 4 .

Tableau 4.

Constantes d'équilibre (nM) des réactions de la figure 1 C

A. Kvaleurs de peptides pour le canal seul par rapport au canal saturé de peptide
Canal seul Canal saturé d'alcaloïde
PeptideRien K (kBR/kRB)KIIIA K (kCalifornie/kCA)KIIIA[K7A] K (kCalifornie/kCA)
Alcaloïde
    TTX38 ± 6730 ± 80045 ± 22
    STX8 ± 26 ± 3
    GTX2/35 ± 17 ± 4
B.Kvaleurs de peptides pour le canal seul par rapport au canal saturé d'alcaloïde
Canal seul Canal saturé d'alcaloïde
AlcaloïdeRien K (kRA/kRA)TTX K (kCB/kavant JC)STX K (kCB/kavant JC)GTX2/3 K (kCB/kavant JC)
Peptide
KIIIA5 ± 5105 ± 254 (1�) × 10 3 † 290 ± 30
KIIIA[K7A]115 ± 40138 ± 3087 ± 18156 ± 62

Équilibre K les valeurs, moyenne ± SD, ont été calculées à partir de kdésactivé/kau ratios (notations des constantes de vitesse correspondantes dans la Fig. 1 C sont indiqués entre parenthèses) les valeurs de ces constantes de vitesse ont été obtenues à partir des tableaux 1 – 3 , à l'exception de celles de kCB et kCalifornie, qui ont été obtenus par simulation numérique, comme décrit dans les méthodes . Valeurs de kCB, en min 𢄡 , étaient (pour les combinaisons de peptide𠄺lcaloïdes indiquées) : 0,021 (KIIIA–TTX) 0,35 (KIIIA–STX) 0,029 (KIIIA–GTX2/3) 0,022 (KIIIA[K7A]–TTX) 0,013 (KIIIA [K7A]–STX) et 0,014 (KIIIA[K7A]–GTX2/3) SD de kdésactivé les valeurs pour les complexes ternaires correspondants dans le tableau 2 ont servi de proxy pour les SD pour kCB valeurs et celles-ci ont été utilisées dans le calcul des SD pour les kCalifornie et K valeurs. Valeurs moyennes de kCalifornie ± SD, en min 𢄡 , étaient (pour les combinaisons de peptide𠄺lcaloïdes indiquées) : 0,0022 ± 0,0024 (KIIIA–TTX) 0,025 ± 0,012 (KIIIA[K7A]–TTX) 0,0038 ± 0,0018 (KIIIA[K7A]–STX) et 0,004 ± 0,0021 (KIIIA[K7A]–GTX2/3).

La valeur de kavant JC a été estimée à partir d'expériences dans lesquelles un alcaloïde a été ajouté avant le peptide et en exploitant la grande disparité entre kCB et kBR (sauf dans un cas, impliquant KIIIA et STX voir paragraphe suivant), qui a produit un cours de temps doublement exponentiel pour la récupération de jeN / A après lavage de la toxine. Les coefficients des ajustements exponentiels doubles ont fourni le kdésactivé valeurs et durées des phases rapide et lente. Dans tous les cas, le jeûne kdésactivé avait une valeur proche (dans un facteur de 𢏂) de kBR (c'est-à-dire, la constante de vitesse pour la récupération du bloc de l'alcaloïde binaire·NaV complexe) et la lenteur kdésactivé avait une valeur proche (dans un facteur de 𢏂) de kCB (c'est-à-dire la constante de vitesse de récupération du bloc du complexe ternaire formé avec des concentrations saturantes d'alcaoïde et de peptide appliquées pendant un temps suffisant pour convertir tout le NaV en un complexe ternaire). Ces résultats ont soutenu l'idée que la durée de la phase lente était susceptible de fournir une bonne estimation de la fraction des canaux qui se trouvaient dans le peptide ternaire୺lcaloïde·NaV complexe au début de l'élimination des toxines (Zhang et al. 2009). Il a été supposé qu'avant le lavage de la toxine, la fraction de complexe ternaire formé (FTCF) en fonction du temps suivait un cours temporel exponentiel unique et donc la valeur estimée pour la constante de vitesse observée kobs a été calculé à partir de l'équation kobs = [ln (FTCF)]/heure. Par souci de simplicité, les données n'ont été obtenues qu'à un seul moment. Cette kobs a été utilisé avec l'équation kobs = kau*[peptide] + kdésactivé et depuis kdésactivé (c'est-à-dire ∼kCB) était invariablement d'un ordre de grandeur inférieur à kobs, l'apparent kau (c'est à dire., kavant JC) a été calculé à partir de kobs/[peptide].

Une procédure différente de celle décrite précédemment a dû être utilisée pour estimer kavant JC dans le cas de STX et KIIIA parce que la différence entre kCB et kBR n'était que quadruple et la durée expérimentale de récupération de jeN / A suivant le lavage de la toxine ne pouvait pas être mieux ajusté par une courbe double exponentielle qu'une simple exponentielle. Au lieu de cela, l'expérience a été simulée en utilisant différentes valeurs pour kavant JC et la valeur produisant des résultats simulés qui correspondaient le mieux aux données expérimentales a été utilisée pour approximer kavant JC. Les autres constantes de vitesse utilisées dans cette approximation sont spécifiées dans les résultats .

Modélisation moléculaire et amarrage de NaV1.2, μ-conotoxine KIIIA, et les alcaloïdes TTX et STX

Un modèle de rat NaV1.2 a été construit en utilisant comme modèle le modèle de rat NaV1.4 proposé par Lipkind et Fozzard (2000), qui était composé de 12 parties des quatre domaines. Chaque domaine était représenté par trois fragments structurels : le segment S5, la boucle P et le segment S6. Analyse de séquence de ces 12 pièces de NaV1.2 et NaV1.4 montre 91,0% d'identité (données non montrées). Nous avons trouvé chaque fragment structurel pour chaque domaine de NaV1.2 qui correspond au modèle de Lipkind et Fozzard de NaV1.4. Notre modèle de NaV1.2 a été construit en introduisant des modifications de résidus spécifiques en utilisant PyMOL (DeLano Scientific, Palo Alto, CA) les résidus de la NaV1.4 modèle ont été remplacés par des résidus de rotamère dépendant du squelette correspondant du NaV1.2 en utilisant la fonction de mutagenèse PyMOL. Le conopeptide KIIIA a été construit avec les coordonnées de Khoo et al. (2009) et les coordonnées de TTX et STX provenaient de Tikhonov et Zhorov (2005).

Amarrage automatisé de TTX, STX et KIIIA au modèle de NaV1.2 a été réalisée à l'aide du progiciel AutoDock4.2 (Morris et al. 2009). Des torsions flexibles de ligands ont été attribuées à l'aide d'AUTOTORS et d'une boîte de grille définie par 60 & x000d7 60 & x000d7 60 points de grille et un espacement de 0,375 Å avec AUTOGRID. Les simulations d'amarrage ont été réalisées à l'aide d'un algorithme génétique lamarckien (Morris et al. 1998), avec les paramètres suivants : taille de la population = 300, taux de mutation = 0,02, taux de croisement = 0,8. Le nombre d'amarrages par simulation était de 50 et 256 pour le conopeptide et l'alcaloïde, respectivement. Le nombre d'amarrages par simulation pour le conopeptide était inférieur à celui pour l'alcaloïde en raison des valeurs plus élevées des torsions flexibles et des temps de simulation plus longs correspondants. Le nombre maximum d'évaluations énergétiques a été fixé à 250 000 et le nombre maximum de générations à 27 000. Une structure représentative du cluster a été sélectionnée à partir de chacun des passages d'amarrage. Les grappes ont été examinées pour la quantité de conformations et celles avec le plus grand nombre ont été choisies pour une analyse plus approfondie. Un critère secondaire pour la sélection d'une structure représentative d'un cluster était la valeur de l'énergie de liaison.


Justification de l'examen de l'effet du doublement de la conductance AMPA

Un doublement de la composante AMPA du courant synaptique évoqué par le glutamate est un exemple de plasticité qui a été observé dans les neurones dopaminergiques en réponse à l'administration de drogues d'abus, à la fois in vivo (Zhang et al. 1997) et in vitro (Borgland et al. 2004). Le rapport du courant postsynaptique excitateur de pointe (EPSC) évoqué par la stimulation de l'AMPA et NLes récepteurs -méthyl-d-aspartate (NMDA) peuvent être mesurés en bloquant pharmaceutiquement tous les autres courants synaptiques, en fixant la tension de la cellule à +40 mV, puis en stimulant la tranche. Dans ces conditions, le rapport du pic AMPA EPSC au pic NMDA EPSC peut être augmenté de 0,38 à 0,75 par une seule injection de cocaïne (Ungless et al. 2001). Une augmentation de la composante AMPA était responsable de ce changement. Le rapport AMPA/NMDA était positivement corrélé à l'activité locomotrice, et Jones et Bonci (2005) ont émis l'hypothèse qu'une augmentation de la réponse AMPA synaptique pourrait entraîner une amélioration de la réponse des neurones dopaminergiques pour récompenser les stimuli associés. De plus, il a été démontré que l'administration iontophorétique d'AMPA augmentait à la fois la fréquence et la fraction des pointes tirées en salves chez des rats anesthésiés à l'hydrate de chloral (Christoffersen et Meltzer 1995).


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Résultats

Expression fonctionnelle des canaux de type ENaC/Deg dans les chondrocytes canins

Nous avons commencé par montrer que nos chondrocytes canins isolés exprimaient une immunoréactivité positive pour les trois sous-unités d'ENaC (α-ENaC, -ENaC et γ-ENaC Figure 1A–F). Ensuite, dans des solutions sans potassium (« Patch Inside-Out » : Tableaux 1 et 2), nous avons observé un petit canal ionique dans 60 % des patchs avec une conductance de pente de 9 ± 1 pS (m = 5) (Figure 1G, I). Cela s'est inversé près du potentiel d'équilibre pour le sodium calculé pour ces conditions (-4,9 mV) (Figure 1I), et la probabilité ouverte () a été significativement réduite par les bloqueurs ENaC/Deg, 10 M d'amiloride (Figure 1I) et 100 nM de benzamil (inhibition de 96 ± 2%, m = 5 et 56 ± 2%, m = 3, respectivement P ≤ 0,05 dans les deux cas, anova ). La cinétique de ce canal à faible conductance était typique des canaux ENaC. Pour quantifier cela, nous avons effectué une analyse cinétique. Étant donné que les canaux ENaC ont une perméabilité inhabituellement élevée pour Li + (Canessa et al., 1994 Schild et al., 1997 Kellenberger et al., 1999), nous avons optimisé les conditions en enregistrant les événements en mode patch attaché à la cellule avec Li + inclus dans la pipette comme porteur de charge (« solution de lithium » : tableau 1). Dans cette configuration, et avec un potentiel membranaire de -80 mV, les courants unitaires étaient <1 pA vers l'intérieur, encore une fois typiques des canaux ENaC/Deg. Les données ont été idéalisées et le modèle ajusté comme décrit dans les méthodes. Initialement, nous avons trouvé que les événements ne pouvaient pas être ajustés de manière satisfaisante avec un modèle simple à deux états (fermé-ouvert), mais qu'ils étaient bien mieux adaptés avec deux états ouverts et deux états fermés (Figure 2). Les constantes de taux de meilleur ajustement sont présentées dans leur intégralité dans le tableau 3. Ces constantes de taux ont été utilisées pour calculer les PDF, les temps d'ouverture moyens et les temps de fermeture moyens de la figure 2.

L'immunohistochimie et l'enregistrement patch-clamp révèlent la présence de l'expression de la protéine ENaC et une conductance cationique sensible au benzamil et à l'amiloride. Coloration par immunofluorescence de ENaC (A), βENaC (B) et γENaC (C) dans des cultures primaires de chondrocytes articulaires canins (cellules de premier passage, objectif 100×). Une immunoréactivité positive pour toutes les sous-unités a été observée bien que la plus forte pour α- et β-ENaC. La concentration des anticorps primaires était de 1 g.mL -1 (dilution 1:200). L'anticorps secondaire était une IgG polyclonale de chèvre contre une IgG de lapin (spécifique de Fc, purifiée par affinité, pré-adsorbée) conjuguée à DyLight® 488 (Abcam ab98462). Après de nombreux lavages dans du PBS-T, les noyaux ont été contre-colorés avec de l'iodure de propidium (fluorescence rouge). La coloration verte montre la protéine ENaC, la coloration orange est les noyaux et la coloration jaune est le chevauchement des deux. (D–F) Le contrôle négatif a été traité de manière identique, mais avec l'omission d'IgG primaire et montre la coloration nucléaire fluorescente rouge avec très peu de fluorescence verte de fond (barres d'échelle pour A–F : 10 m). (G–J) Enregistrements de patch clamp à l'envers à partir de chondrocytes canins à l'aide de solutions à l'envers : tableaux 1 et 2. (G) Traces d'activité à canal unique à faible conductance à l'envers aux potentiels membranaires donnés. La ligne horizontale de la barre d'échelle est de 100 ms, la ligne verticale est de 500 fA. (H) Histogramme d'amplitude tous points pour le canal à faible conductance à -40 mV. (I) Courbe courant-tension à canal unique pour le canal à faible conductance. Vtour était de -1 ± 5 mV (m = 5), conductance de pente 9 ± 1 pS (m = 5). (J) Probabilité ouverte (Po) en fonction du temps, calculé sur des fenêtres successives de 0,4 s avant et pendant l'ajout de l'inhibiteur du canal ENaC, l'amiloride (10 M). Canal unique à faible conductance Po a été réduit de 96 ± 2% (m = 5).

Analyse cinétique du canal cationique à faible conductance. L'analyse cinétique de la faible conductance de type ENaC/Deg a été réalisée dans des conditions de patch attaché aux cellules. Li + a été inclus dans le patch-pipette et a servi de porteur de charge (Solutions : Tableau 1). (A) Panneau supérieur, l'enregistrement idéalisé SKM à partir de cette trace (voir Méthodes). Panneau inférieur, tracé monocanal brut à -80 mV, ligne de base corrigée. (B) Un exemple de distribution en temps fermé de patch superposé à un PDF bi-exponentiel calculé à partir du panneau D : (τ1, aire) : 5,9 ms, 0,83, (τ2, aire) : 94,5 ms, 0,17. Moyenne : 21,0 ms. (C) Un exemple de distribution en temps ouvert, à nouveau ajusté avec un PDF bi-exponentiel calculé à partir du panneau D : (τ1, aire) : 3,1 ms, 0,5, (τ2, aire) : 26,5 ms, 0,46. Moyenne : 13,8 ms. (D) Schéma de notre modèle cinétique le mieux adapté, données complètes dans le texte (tableau 3). Tout au long de cette figure, le rouge est utilisé pour désigner les états fermés et le bleu pour l'état ouvert.

De À K (s −1 ) SEM
État 1 État 2 Moyenne
Fermé (2) Ouvert (3) 183.4 21.8
Ouvert (3) Fermé (2) 203.8 5.1
Fermé (2) Fermé (1) 19.3 3.0
Fermé (1) Fermé (2) 14.6 3.7
Ouvert (3) Ouvert (4) 41.7 17.0
Ouvert (4) Ouvert (3) 38.6 9.8

We next investigated whether constitutive activity of these channels influenced the cellular membrane potential (Vm). We used standard physiological saline solutions (extracellular: Table 1, intracellular: Table 2) and measured Vm in current clamp mode. Contrôler Vm was −13.2 ± 3.8 mV, similar to previously reported resting membrane potentials in chondrocytes (Wright et al., 1992 , Lewis et al., 2011a ). Application of 10 μM amiloride caused the Vm to became significantly more negative ( Figure 3A, 9.5 ± 0.8 mV, m = 5). Addition of 100 nM benzamil (Figure 3B), an even more specific inhibitor of ENaC (Kellenberger and Schild, 2002 Alexander et al., 2011 ), also significantly changed Vm (7.5 ± 1.7 mV, m = 5 hyperpolarization, P ≤ 0.05 anova ). These effects were reversible and dose-related (Figure 3A–C).

Whole-cell patch clamp shows the presence of a sodium conductance characteristic of ENaC. (A and B) Whole-cell current clamp recordings of a canine chondrocyte in ‘physiological saline solutions’ (Tables 1 and 2, including 145 mM external NaCl). Application of either amiloride (A) or benzamil (B) reversibly hyperpolarize the membrane. Mean values given in the text. (C) Comparison of the effect of amiloride and benzamil on membrane potential in a number of experiments such as those shown in panels A and B. Data are fitted with Equation 3, where R is the change in membrane potential (dVm). Hill slope (h) was constrained to unity, m for amiloride was −13 ± 1.2 mV and pD2 = 5.5 ± 0.1, for benzamil m was −8.2 ± 0.3 mV and pD2 = 8.4 ± 0.07 (benzamil from eight cells, amiloride each point, three to five cells). (D) Representative whole-cell voltage ramps in ‘ENaC permeability’ solutions (Tables 1 and 2). The current traces shown illustrate a recording in control and then 1 μM benzamil solution. The resulting difference currents for each combination of solutions is shown in panel F. (E) Representative continuous whole-cell voltage clamp recordings as a chondrocyte is superfused with 1 μM benzamil. The small constitutive inward current is blocked resulting in an increase in outward current corresponding to a mean total whole-cell conductance of 1.5 ± 0.4 nS (m = 9). (F) Mean benzamil difference currents with 22 (49), 66 (13), 110 (6) and 150 (7) mM intracellular sodium (calculated Na equilibrium potential in mV) are shown (m = 14). (G) Mean Vrev plotted against intracellular sodium concentration. The smooth line represents a fit to Equation 2 with P (PN / A/PK) of 24.

To determine the sodium permeability of the benzamil-sensitive current (relative to K + ), we switched to whole-cell voltage clamp. With the standard physiological solutions and at a holding potential of −15 mV, application of 1 μM benzamil blocked a small constitutive inward current and resulted in an outward current deflection (mean conductance 1.5 ± 0.4 nS, m = 9, Figure 3). Whole-cell voltage ramps were then run in the presence and absence of benzamil, using four different intracellular sodium concentrations optimized for recording ENaC currents (22, 66, 110 and 150 mM). Subtraction of the whole-cell currents in the presence of benzamil from those recorded in vehicle gave the benzamil difference currents shown in Figure 3F. Difference currents at four different intracellular sodium concentrations were obtained (Figure 3F, G), and the reversal potentials for these followed the calculated changes in Na + equilibrium potential (Figure 3G).

Finally, we investigated whether ENaC/Deg channel activity contributed to canine chondrocyte RVI. In cell-attached patch experiments (protocols as above), with Li + as the charge carrier (‘Lithium solution’: Table 1), we found that increasing bath/extracellular osmotic pressure with addition of 180 mM sucrose activated ENaC channels (Figure 4), significantly increasing the open probability of the ENaC/Deg-like channel (from 0.27 ± 0.05 to 0.54 ± 0.07, m = 10, P ≤ 0.05, paired t-test). In volume recording experiments, we found hypertonic challenge first led to shrinkage, but that within 20 min, volume recovered in approximately 50% of cells. Such volume recovery is termed RVI, and only cells that exhibited RVI under control conditions were used in the following experiments. In cells exhibiting RVI, volume recovered to 92 ± 4%, m = 8 (Figure 5B). The ability of these cells to undergo RVI was maintained when the extracellular Na + was completely replaced by Li + (Figure 5D), suggesting a Li + -permeable channel is involved. In Li + solutions, cells exhibited slightly less shrinkage this was still statistically significant shrinkage to 74 ± 3%, P < 0.001 and within 20 min of maximum shrinkage returned to 94 ± 2% of starting volume. RVI was inhibited by benzamil with a PD2 of 7.5 (see Figure 5 for details).

The ENaC/Deg-like channel is activated by exposure to hypertonic solutions. (A) Cells were initially equilibrated in 309mOsm and then switched to 489mOsm as indicated by the bar. Osmolarity was increased with addition of sucrose. An ensemble average of single channel activity is shown (m = 9 patches) the mean increase in current was 4.67 ± 1.7 pA (m = 8, P ≤ 0.05), and this increase was not seen in the presence of 1 μm benzamil. (B) Representative section taken from one of the 309mOsm records averaged in panel A. (C) Representative section taken from one of the 489mOsm records averaged in panel A.

RVI is retained in lithium, but sensitive to low concentrations of benzamil. (A) Confocal images showing changes of cell volume with time. The top panels show the chondrocyte from above (X–Y plane), and the lower panels show the reconstructed cell view from the side (Z–X plane). In order to capture relatively rapid volume changes, scan resolution was set to a low value (31 Z layers per time slice). These images were necessary to verify that cells were approximately spherical (please see Methods: Equation 1). 60× objective scale bar 20 μm. (B) Under control conditions, when cells are incubated in 309mOsm physiological saline (Table 1) then exposed to hypertonic solutions (489mOsm), they first shrink passively as water leaves the cell via osmosis (marked ‘I’). They then swell through the process of RVI, eventually returning to the starting volume (RVI indicated by ‘II’). Osmolarity was increased with addition of sucrose. Not all cells underwent RVI. We use a two-exposure protocol. Only those cells that exhibited RVI on the first exposure to hypertonic challenge were then used for these experiments. The second exposure either contained benzamil or further control vehicle solution, mean of eight cells. (C) The same protocol as that used in panel B, but with the presence of 100 nM benzamil RVI is inhibited. Mean of five cells. (D) RVI protocol with extracellular Na + replaced by Li + . For (B) to (D) solid filled markers indicate data points and the solid line (and oui-axis on the right) indicates the osmolarity. (E) Concentration inhibition curve for inhibition of RVI by benzamil. Five cells per concentration. Data are represented as fractional recovery from the theoretical maximum shrinkage (0.63 = 309/489) and fit with Equation 3, where R is fractional recovery, m was 0.84 ± 0.2, h is 3.5 ± 0.9 and pD2 =7.5 ± 0.01. (F) Schematic of our working model for RVI, with phases ‘I’ and ‘II’ indicated.


Remerciements

Remerciements: Supported by a grant from the Belgian Science Policy (IAP VII/19) and by the 𠇏onds Léon Fredericq”. G.D. is a Marie-Curie COFUND postdoctoral fellow at the University of Liege. Co-funded by the European Union. J.D. is supported by the F.R.S.-FNRS (Belgian Fund for Scientific Research). The authors acknowledge constructive discussions with Prof. Vincent Seutin (Universiy of Liège), Prof. Pierre Maquet (University of Liège), Dr. Timothy O’Leary (Brandeis University), and Prof. Eve Marder (Brandeis University).


Functional domains within the degenerin/epithelial sodium channel (Deg/ENaC) superfamily of ion channels

Corresponding author Dale J. Benos: Department of Physiology and Biophysics, University of Alabama at Birmingham, 1918 University Boulevard, Birmingham, AL 35294-0005, USA. Email: [email protected] Search for more papers by this author

Department of Physiology, Dartmouth Medical School, Hanover, NH 03755-3830, USA

Department of Physiology and Biophysics, University of Alabama at Birmingham, 1918 University Boulevard, Birmingham, AL 35294-0005, USA

Corresponding author Dale J. Benos: Department of Physiology and Biophysics, University of Alabama at Birmingham, 1918 University Boulevard, Birmingham, AL 35294-0005, USA. Email: [email protected] Search for more papers by this author

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Résumé

Application of recombinant DNA technology and electrophysiology to the study of amiloride-sensitive Na + channels has resulted in an enormous increase in the understanding of the structure-function relationships of these channels. Moreover, this knowledge has permitted the elucidation of the physiological roles of these ion channels in cellular processes as diverse as transepithelial salt and water movement, taste perception, volume regulation, nociception, neuronal function, mechanosensation, and even defaecation. Although members of this ever-growing superfamily of ion channels (the Deg/ENaC superfamily) share little amino acid identity, they are all organized similarly, namely, two short N- and C-termini, two short membrane-spanning segments, and a very large extracellular loop domain. In this brief Topical Review, we discuss the structural features of each domain of this Deg/ENaC superfamily and, using ENaC as a model, show how each domain relates to overall channel function.

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High-Level Expression and Functional Reconstitution of Shaker K+ Channels

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