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Existe-t-il des modèles animaux pour Clostridium difficile qui reproduisent mieux l'infection humaine que les hamsters ?


Je cherche donc des informations sur la dose infectieuse nécessaire pour coloniser un humain avec Clostridium difficile. Il n'y a pas d'études de provocation humaine, et comme il ne s'agit pas d'un agent pathogène d'origine alimentaire, nous pouvons obtenir peu de données sur les épidémies.

Ce qui me laisse regarder des modèles animaux, pour au moins obtenir le forme de la probabilité d'infection en fonction d'une dose donnée. Mais les articles sur les hamsters laissent croire qu'ils s'infectent assez facilement, et que cette infection est particulièrement grave.

Existe-t-il un autre modèle animal qui imite plus fidèlement la dynamique d'infection des C. difficile chez l'homme ?


Les hamsters sont considérés comme le meilleur modèle animal, le plus étudié.
C. difficile a été trouvé chez les veaux, les autruches, les poulets, les éléphants, les chiens, les chevaux et les porcs, mais son rôle dans l'infection et sa pathogenèse chez les animaux sont largement mal compris et peut-être sous-estimés.


Des souris à microbiote humanisé comme modèle de récurrence Clostridium difficile maladie

Clostridium difficile La maladie est la principale cause associée aux antibiotiques de diarrhée et d'infection nosocomiale acquise dans le monde occidental. Le fardeau annuel aux États-Unis seulement s'élève à 250 000 cas avec 14 000 décès imputés et des coûts médicaux supérieurs à un milliard de dollars. De nouveaux modèles pour l'étude de C. difficile l'infection sont donc pertinents.

Résultats

Des souris C57BL/6 sans germe gavées avec un microbiote fécal humain sain ont maintenu un microbiote «humanisé» stable sur plusieurs générations lorsqu'elles sont hébergées dans des conditions spécifiques sans agent pathogène (SPF). Comme pour les souris contenant un microbiote conventionnel, le traitement par un cocktail de cinq antibiotiques suivi d'une dose unique de clindamycine rend les animaux sensibles à C. difficile infection (ICD). Fait intéressant, après la guérison de l'infection initiale par l'ICD, une seule injection intrapéritonéale de clindamycine est suffisante pour induire une rechute de l'ICD. Une rechute de l'ICD peut être induite jusqu'à 35 jours après l'infection après la guérison de l'infection initiale, et de multiples épisodes de rechute peuvent être induits.

Conclusion

Ce modèle permet d'étudier la récurrence C. difficile maladie chez un hôte contenant un microbiote d'origine humaine. Les traitements probiotiques utilisant des microbes d'origine humaine, qu'ils soient prophylactiques ou curatifs, peuvent être testés dans le modèle. L'identification et les tests de communautés microbiennes d'origine humaine au sein d'un modèle de souris à microbiote humanisé peuvent permettre un taux plus élevé de transfert réussi de traitements à base de bactéries du laboratoire aux patients humains en raison des microbes impliqués qui sont initiés et adaptés à l'humain. Tractus gastro-intestinal.


Introduction

Clostridioides difficile a été établi comme l'agent causal de la colite pseudomembraneuse en 1978 et est depuis devenu l'une des infections nosocomiales les plus fréquemment rencontrées aux États-Unis. 1,2 Une étude de surveillance en population et en laboratoire a estimé que le fardeau national de C. difficile L'infection (ICD) aux États-Unis était de 462 100 cas en 2017. 3 Les coûts de traitement annuels liés à l'ICD sont estimés à 4,8 milliards de dollars américains dans les établissements de soins de courte durée aux États-Unis, avec une charge supplémentaire dans les établissements de soins ambulatoires et les établissements de soins de longue durée. 4 Une revue systémique et une méta-analyse récentes ont examiné les rapports des taux d'incidence d'ICD pour développer une estimation des preuves mondiales actuelles de l'infection. Ils ont estimé que le taux d'incidence global des ICD associées aux établissements de santé était de 2,24 pour 1 000 admissions par an et de 3,54 pour 10 000 jours-patients. 5 Une autre analyse systémique mondiale, qui comprenait 195 pays, a établi que C. difficile était responsable de la plupart des décès chez les enfants de moins de 5 ans et parmi tous les groupes d'âge dans les pays ayant un indice sociodémographique plus élevé. 6

La réponse de l'hôte au C. difficile bactérie va du portage asymptomatique, de la diarrhée légère à la colite potentiellement mortelle et, dans certains cas, même la mort. 7 La récurrence de la maladie après une infection initiale continue de poser l'un des plus grands défis dans sa gestion. Une ICD récurrente est observée chez 15 % des patients après une première infection et chez 33 % des patients qui ont eu deux infections ou plus. 8 Le large éventail de résultats est influencé par les facteurs de virulence bactérienne, notamment les toxines codées dans le locus de pathogénicité, les facteurs d'adhérence et de motilité, ainsi que les comorbidités de l'hôte et les réponses immunitaires. 9 La présence d'un microbiome intestinal sain a également une incidence sur le développement de l'ICD car il offre une résistance contre C. difficile la colonisation. 10 Les taux de colonisation asymptomatique chez les adultes en bonne santé ont atteint 17,5 %. 11 � Les colonisateurs asymptomatiques peuvent servir de porteurs potentiels de la maladie et risquent de transmettre l'ICD à d'autres ou peuvent évoluer eux-mêmes vers l'infection s'ils sont porteurs des souches toxigènes. 14,15 Bien que la perturbation du microbiome intestinal protecteur, principalement par l'utilisation d'antibiotiques, puisse prédisposer à l'ICD, 16 le système immunitaire de l'hôte détermine également le développement d'une maladie symptomatique et on pense qu'une réinfection répétée de l'environnement entraîne un anticorps protecteur. réponse chez les adultes en bonne santé. 17 La prise de conscience du rôle essentiel que joue la réponse immunitaire humaine dans la pathogenèse de la maladie a également conduit au développement de thérapies médicamenteuses ciblant le système immunitaire.


Introduction

Selon les données publiées par l'Organisation mondiale de la santé (OMS), les agents infectieux causant des infections des voies respiratoires inférieures, des maladies diarrhéiques et la tuberculose ont été classés parmi les dix premières causes de décès dans le monde, entraînant 5,7 millions de décès en 2016 (1). Il est clair que nous devons améliorer notre compréhension de ces maladies et agents pathogènes afin de développer des médicaments et des vaccins plus efficaces. À cette fin, nous avons besoin d'un modèle animal approprié qui puisse imiter le plus précisément la pathogenèse de l'infection, car l'infection induit généralement un processus complexe de réponses immunitaires de l'hôte qui in vitro les expériences sont incapables de simuler. Seul in vivo les modèles peuvent évaluer avec précision la complexité des réponses de l'hôte et permettre d'évaluer l'efficacité et les effets indésirables des médicaments ou des vaccins.

Le hamster syrien (Mesocricetus auratus) est utilisé comme modèle animal pour étudier les maladies d'origine humaine depuis plus de 60 ans. Un certain nombre d'études ont documenté que les hamsters syriens représentent de meilleurs modèles pour l'analyse des infections virales par rapport aux modèles murins, car la similitude avec les humains en ce qui concerne les symptômes de la maladie, la pathogénèse et les réponses immunitaires est plus grande (2𠄴). Il a été démontré par nous et d'autres que les cytokines humaines, y compris le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et l'interleukine-12 (IL-12), sont pleinement fonctionnelles dans les modèles de hamster, mais pas dans les modèles de souris (5, 6). Avec d'autres avantages, tels que le taux de reproduction rapide et la facilité de manipulation, les hamsters syriens sont un choix supérieur par rapport aux autres petits animaux.

Bien que les hamsters syriens aient été historiquement utilisés dans la recherche sur les maladies, leur valeur en tant que modèle animal dans l'étude des maladies infectieuses n'a été prise en compte que récemment. Avec les progrès des technologies d'édition de gènes, leur popularité a considérablement augmenté (Figure 1). L'utilisation de modèles de hamsters syriens génétiquement modifiés (GESH) est essentielle pour comprendre la progression de la maladie et pour développer des schémas thérapeutiques prophylactiques et thérapeutiques. Le premier hamster syrien KO (KO) du gène STAT2 a été développé en 2014, en utilisant le système CRISPR/Cas9 pour cibler la lignée germinale du hamster (7). STAT2 est un élément crucial de la voie de transduction du signal de l'interféron de type I (IFN) et le modèle de hamster est devenu le seul petit modèle animal permissif pour l'infection par l'adénovirus (AdV), ainsi, le modèle STAT2 KO a été essentiel pour la caractérisation de l'adénovirus pathogenèse (8).

Figure 1. Nombre de publications utilisant le hamster syrien comme modèle de maladie. Le nombre de publications utilisant des hamsters syriens comme modèle animal de 1997 à 2017 est indiqué. Pour chaque standard, le nombre de publications a été déterminé via une recherche utilisant la base de données ScienceDirect. La recherche a été effectuée avec les mots clés “Syrian hamster” ou “golden hamster” AND “model” AND (1) “viral” ou “virus,” (2) �teria, ” (3) “infection” ou “maladie”.


Clostridium difficile et le microbiote

Division des maladies infectieuses, Département de médecine interne et Département de microbiologie et d'immunologie, Université du Michigan, Ann Arbor, Michigan, États-Unis.

Adressez la correspondance à : Vincent B. Young, Department of Internal Medicine, Division of Infectious Diseases, University of Michigan Medical School, 1520B MSRB I, 1500 W. Medical Center Drive, Ann Arbor, Michigan 48109, États-Unis. Téléphone : 734.764.2237 Courriel : [email protected]

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Clostridium difficile L'infection (ICD) est la principale maladie associée aux soins de santé. Les modèles humains et animaux ont démontré l'importance de la capacité du microbiote intestinal à fournir une résistance à la colonisation contre C. difficile. Les facteurs de risque de développement de la maladie comprennent l'utilisation d'antibiotiques, qui perturbent le microbiote intestinal, entraînant la perte de la résistance à la colonisation et l'ICD subséquente. L'identification des microbes spécifiques capables de restaurer cette fonction reste insaisissable. De futures études portant sur la façon dont les communautés microbiennes influencent l'environnement métabolique pourraient aider à élucider le rôle du microbiote dans le développement de la maladie. Ces résultats permettront d'améliorer les biothérapies actuelles pour les patients atteints d'ICD, en particulier ceux présentant une maladie récurrente.

Identifié pour la première fois en 1935, Clostridium difficile est devenue l'une des principales causes d'infections nosocomiales ( 1 , 2 ). L'augmentation de la gravité et de la morbidité observée au cours de la dernière décennie est très préoccupante. Aux États-Unis, on estime que 14 000 décès sont attribués à C. difficile infection (ICD) annuellement, avec des coûts associés compris entre 1 et 3 milliards de dollars (3). De plus, les options thérapeutiques initiales échouent chez 20 à 30 % des patients, ce qui entraîne une récidive de la maladie. Ces augmentations de la charge CDI se sont produites en conjonction avec l'émergence de souches hyperendémiques (4, 5).

Depuis la découverte de C. difficile en tant qu'agent étiologique de la diarrhée associée aux antibiotiques, nous en sommes venus à apprécier l'importance des changements dans les microbes intestinaux indigènes, appelés collectivement le microbiote, dans le développement de l'ICD (6). On estime que ces microbes contiennent 100 fois plus de potentiel génétique que notre propre génome. Ainsi, le microbiote peut fournir des fonctions que l'hôte seul ne peut pas fournir, telles que la dégradation des nutriments essentiels, le métabolisme des médicaments, le développement immunitaire et la résistance aux agents pathogènes (7). Les avancées technologiques récentes ont amélioré notre compréhension du rôle du microbiote dans la pathogenèse de l'ICD. La présence d'un microbiote intestinal sain est particulièrement pertinente dans le développement de l'ICD, et les futures stratégies thérapeutiques reposeront sur une compréhension plus complète du rôle du microbiote dans la prévention des maladies. Dans cette revue, nous discuterons de nos connaissances actuelles sur le rôle du microbiote dans la pathogenèse de l'ICD.

Une compréhension de la pathogenèse de l'ICD est cruciale dans le traitement et la prévention des maladies (Figure 1). C. difficile est un anaérobie obligatoire, acquis par ingestion de spores par voie fécale-orale. Ces spores peuvent survivre même dans des conditions environnementales difficiles (8). Parce que C. difficile les spores sont également résistantes aux nettoyants à base d'alcool, les spores sont particulièrement répandues dans les environnements hospitaliers et ont été détectées des mois après l'exposition initiale (9, 10). Infection par une souche toxinogène de C. difficile entraîne une gamme de signes et de symptômes cliniques, allant de la diarrhée et des crampes dans les cas bénins au développement de la colite pseudomembraneuse et même la mort dans la maladie grave. Bien que la plupart des cas d'ICD soient liés aux soins de santé, un pourcentage des cas surviennent dans la communauté et semblent ne pas être liés à l'utilisation d'antibiotiques ou à une exposition antérieure aux soins de santé (Figure 1 et réf. 11 ). Une récente étude d'épidémiologie moléculaire par Eyre et al. qui a utilisé le séquençage du génome entier pour suivre l'exposition et la transmission de C. difficile ont conclu qu'un tiers des cas d'ICD n'étaient pas associés à l'hôpital (12). De plus, seulement un tiers des cas étaient génétiquement liés les uns aux autres, ce qui suggère une source alternative de C. difficile exposition. C. difficile des spores ont été détectées dans diverses sources environnementales, y compris les animaux domestiques, les sources d'eau et le sol (13). Un autre réservoir potentiel de C. difficile réside dans la population infantile, dans laquelle on estime que la colonisation se produit chez jusqu'à 45% des individus (14, 15). Le microbiome du nourrisson est distinct de celui des adultes et les différences dans le microbiome peuvent être importantes à la fois pour la colonisation et la résistance aux maladies (16, 17). Bien que des taux élevés de C. difficile la colonisation sont observées chez les nourrissons, ils développent rarement la maladie. Il a été postulé que les nourrissons pourraient ne pas avoir le récepteur nécessaire au développement de la maladie (18) ou que des composés présents dans le lait maternel, tels que les IgA maternels, pourraient empêcher la liaison des toxines (19). De futures études analysant les différences dans le microbiome du nourrisson colonisé pourraient fournir des informations utiles sur des microbes spécifiques qui protègent contre C. difficile colonisation et infection.

Pathogénie de l'IDC. Le développement de la maladie dépend des différents stades de la C. difficile cycle de la vie. L'exposition initiale aux spores provenant de diverses sources n'entraîne pas nécessairement une maladie, en particulier chez un individu en bonne santé. Un microbiote sain et diversifié est capable d'interférer avec C. difficile germination des spores et croissance végétative. Cependant, si l'environnement métabolique et microbien de l'intestin a été perturbé, la germination des spores, la croissance végétative et la production de toxines se produiront. Les dommages épithéliaux, l'inflammation et la maladie cliniquement manifeste résulteront de la production de toxines. Sporulation de C. difficile, la libération de spores dans l'environnement et la transmission à de nouveaux hôtes perpétuent le cycle infectieux.

Une fois ingérées, les spores doivent germer et se développer en cellules végétatives qui colonisent le tractus gastro-intestinal. L'exposition aux spores ne se traduit pas toujours par une colonisation, car l'environnement gastro-intestinal doit être favorable pour que ces événements se produisent. Des études in vitro indiquent que la germination et la croissance dans la forme végétative dépendent de la présence d'acides biliaires primaires spécifiques, tels que le taurocholate (20, 21). A l'inverse, d'autres acides biliaires secondaires, comme le chénodésoxycholate, inhibent la germination des C. difficile spores (22). Les microbes du tractus gastro-intestinal jouent un rôle clé dans le métabolisme des acides biliaires (23) et il est supposé que la modulation de la communauté microbienne peut avoir un impact sur la disponibilité des métabolites. Giel et al. ont déterminé que les extraits caecaux de souris traitées aux antibiotiques contenaient des niveaux élevés de sels biliaires et favorisaient la germination des spores, contrairement aux extraits caecaux de souris non traitées (24). De même, Theriot et al. observé des changements significatifs dans le métabolome des souris traitées aux antibiotiques qui sont corrélés à des changements dans la structure de la communauté microbienne (25). Des études sur l'homme et sur la souris in vivo ont révélé l'importance des acides biliaires dans C. difficile germination et continuer à améliorer nos connaissances sur la germination des spores (25 - 27).

Une fois colonisé, C. difficile peut entraîner une inflammation et une maladie causées par des toxines. C. difficile produit 2 toxines majeures responsables de la maladie, les grandes toxines clostridiennes A et B (TcdA et TcdB). Ces toxines, produites pendant la phase stationnaire de la croissance végétative, sont en grande partie responsables des dommages à l'épithélium muqueux et de l'induction d'une réponse inflammatoire (28). Une autre toxine, la C. difficile toxine binaire (CDT), a été observée pour perturber le cytosquelette d'actine, et certaines études suggèrent que sa présence peut augmenter la virulence de la souche (29, 30), cependant, sa présence n'est pas toujours en corrélation avec la gravité de la maladie (31). Le cycle de vie dynamique de C. difficile est complexe et de multiples facteurs liés à l'hôte peuvent être impliqués à chaque étape (Figure 2). Depuis l'exposition aux spores et C. difficile la colonisation n'entraîne pas nécessairement une maladie clinique, la communauté microbienne gastro-intestinale et l'hôte peuvent jouer un rôle important dans le développement de la maladie tout au long du cycle de vie de C. difficile.

Mécanismes proposés du microbiote sur la résistance des pathogènes et de l'hôte au cours de l'ICD. (UNE) Les facteurs microbiens et hôtes peuvent inhiber la germination et la croissance des C. difficile. Un microbiote sain est capable de consommer à la fois des métabolites microbiens et générés par l'hôte, limitant la croissance de C. difficile. La diaphonie entre le microbiote et le système immunitaire de l'hôte entraîne une réponse immunitaire régulée. De plus, le microbiote peut stimuler la production de peptides antimicrobiens et d'IgA sécrétoires (sIgA) qui peuvent maintenir la composition du microbiote. (B) La perturbation du microbiote, due à des facteurs tels que l'utilisation d'antibiotiques, de médicaments, l'alimentation ou l'inflammation, peut conduire au développement d'ICD. Un microbiote dysbiotique peut entraîner une perte de résistance à la colonisation en raison de modifications de l'environnement structurel et/ou métabolique. La perte de membres spécifiques de la communauté affecte potentiellement les niveaux de métabolites microbiens et générés par l'hôte, entraînant un état fonctionnel différent qui favorise la germination des spores et la croissance végétative. Un microbiote dysbiotique peut également entraîner une réponse immunitaire déséquilibrée par la perte de la régulation immunitaire et un état pro-inflammatoire, qui peuvent tous deux affecter le développement de la maladie. Production de toxines par végétatif C. difficile peut stimuler la production de cytokines inflammatoires, de neutrophiles et d'anticorps antitoxine.

Au cœur de la pathogenèse de l'ICD se trouve la perturbation du microbiote (Figure 2). Un microbiote intestinal sain est nécessaire pour se protéger contre la colonisation par des agents pathogènes, appelée résistance à la colonisation (32). Un microbiote non perturbé est capable de résister à la colonisation par des agents pathogènes, et plusieurs mécanismes ont été suggérés pour expliquer pourquoi la perturbation du microbiote entraîne une perte de résistance à la colonisation, notamment la compétition pour les nutriments, la compétition écologique et l'exclusion de niche (33). Alors que de nombreux facteurs de risque associés à l'ICD peuvent entraîner une perturbation du microbiote, le facteur le plus couramment associé est l'utilisation d'antibiotiques. Des changements à court et à long terme ont été observés dans le microbiote intestinal suite à l'utilisation d'antibiotiques. Les diminutions de la diversité du microbiote intestinal sont détectables dans les jours suivant l'utilisation d'antibiotiques, bien que les changements de composition puissent dépendre de l'antibiotique utilisé ainsi que de la communauté microbienne sous-jacente de l'individu (34, 35). La reconstitution de la diversité microbienne se produit après l'arrêt de l'utilisation d'antibiotiques, mais peut également entraîner une modification de la structure de la communauté. Dethlefsen et al. ont constaté que bien que le rétablissement ait commencé dans les semaines suivant l'arrêt de la ciprofloxacine, la nouvelle communauté n'incluait pas nécessairement tous les membres de la communauté observés avant l'utilisation d'antibiotiques (36). Les classes d'antibiotiques associées au développement de l'ICD comprennent la clindamycine, les céphalosporines et les pénicillines (37).

L'augmentation de l'âge, un autre facteur de risque connu pour le développement de l'ICD, a également été observée pour avoir un impact sur la structure du microbiome. Le microbiome intestinal humain subit des changements extrêmes tout au long de la vie, et il n'est pas surprenant que des changements dans la composition microbienne aient été observés chez les personnes âgées (38, 39). Alors que le microbiome intestinal des adultes en bonne santé semble relativement stable au fil du temps, il a été observé que le microbiome intestinal des personnes âgées était en mouvement et moins diversifié. Des études sur le microbiote dans des cohortes de personnes âgées ont observé une diminution des espèces protectrices, telles que Bifidobactéries et certains membres de Firmicutes, ainsi qu'une augmentation des Bacteroidetes et des espèces plus nuisibles, telles que les Proteobacteria (38, 40). Ces changements semblent accompagner partiellement la dégradation du système immunitaire chez les personnes âgées, appelée immunosénescence. Compte tenu de ces observations, il n'est pas surprenant que le taux d'ICD soit plus élevé chez les personnes âgées de 65 ans et plus et représente la majorité des cas de diarrhée dans les établissements de soins de longue durée (41-43). Bien qu'il soit possible que l'âge soit un facteur de risque indépendant d'ICD, l'âge avancé est également associé à une utilisation accrue d'antibiotiques, à des visites à l'hôpital plus fréquentes et au développement de maladies en général, qui ont tous un impact C. difficile susceptibilité.

D'autres facteurs de risque associés au développement de l'ICD ont également le potentiel de perturber le microbiote (Figure 2). L'utilisation d'inhibiteurs de la pompe à protons (IPP), en particulier en association avec des antibiotiques, a été corrélée à une incidence plus élevée d'ICD dans certaines études (44, 45). Il est émis l'hypothèse que les IPP, qui augmentent généralement le pH de l'estomac, peuvent affecter d'autres sites gastro-intestinaux et sont ainsi capables de moduler le microbiote (46). En effet, des études in vitro ont montré que les IPP peuvent affecter la croissance des Lactobacilles, un résident commun de la bouche et de l'intestin (47).

Les patients souffrant d'autres maladies gastro-intestinales peuvent également être plus susceptibles d'acquérir C. difficile. Les maladies inflammatoires de l'intestin (MII) ont été liées à des conséquences plus graves de la maladie et s'avère de plus en plus être un facteur de risque d'ICD (48, 49). Une diminution de la diversité des Firmicutes et des Bacteroidetes a été observée dans le microbiote des patients atteints de MICI (50). De plus, le microbiote des patients atteints de MICI a été associé à la présence de plusieurs bactéries potentiellement pathogènes, principalement au sein du phylum des Proteobacteria (51, 52). Cependant, l'impact de ces communautés sur la susceptibilité à C. difficile lui-même apparaît complexe.

La réponse immunitaire de l'hôte a également la capacité de moduler le microbiote. L'observation que l'IBD peut aggraver l'évolution de la maladie de l'ICD suggère que l'inflammation peut contribuer au développement de l'ICD. Les produits inflammatoires, tels que les peptides antimicrobiens lipocaline-2 et calprotectine, limitent la disponibilité des nutriments dans l'environnement intestinal, affectant potentiellement la croissance des microbes environnants (53, 54). Ces changements peuvent fournir un environnement plus propice pour C. difficile colonisation et CDI subséquente. En plus des modifications du microbiome induites par l'inflammation, d'autres réponses immunitaires induites par l'hôte peuvent être impliquées dans l'issue de la maladie. Le type de communauté intestinale peut potentiellement affecter le répertoire d'IgA muqueux résident (55), et une réduction des cellules productrices d'IgA a été observée dans les biopsies coliques de patients atteints d'une maladie récurrente (56). Divers microbes ont également été observés pour avoir un impact sur des sous-ensembles de cellules T, tels que l'induction de Tregs par Clostridium espèces (57) et différenciation des cellules Th17 par des bactéries filamenteuses segmentées (58). La modulation de ces populations microbiennes, comme après les antibiotiques, est susceptible d'influencer la colonisation des agents pathogènes. Russell et al. ont observé que le traitement à la vancomycine chez la souris a entraîné une diminution de l'abondance de Bactéroïdes espèces dans l'intestin, ce qui était corrélé à une diminution de l'abondance des Tregs coliques (59). Il est probable que les facteurs de l'hôte, modulés ou non par les antibiotiques, affectent l'issue de la maladie.

Le Human Microbiome Project a révélé l'étendue des variations au sein du microbiote intestinal « sain » ou « normal » (60). Ces observations ont nettement affiné notre définition de la dysbiose au sein du microbiote intestinal et continuent de compliquer le rôle causal du microbiome dans le développement de la maladie. À l'avenir, nous espérons répondre à des questions plus mécanistes sur les facteurs de risque corrélés à la perturbation du microbiote et au développement de l'ICD.

Alors que l'importance générale du microbiote intestinal dans le développement de l'ICD est bien établie, les microbes exacts responsables de la protection ou de la sensibilité restent insaisissables (tableau 1). Le manque d'échantillons humains prospectifs avant le CDI a compliqué l'identification des signatures du microbiome qui sont en corrélation avec la protection. Plusieurs études transversales ont comparé des échantillons de patients atteints d'ICD avec des échantillons de patients en bonne santé et de patients non atteints d'ICD souffrant de diarrhée. Les nourrissons représentent une population intéressante à étudier, car la plupart des nourrissons peuvent être colonisés mais ne développent pas de maladie. Rousseau et al. observé que C. difficile la colonisation chez les nourrissons s'accompagnait de la présence de Ruminocoque et Klebsiella espèces, tandis que Bifidobactérie semblait protecteur contre la colonisation (17). Plusieurs études ont également comparé des échantillons de populations âgées, plus sensibles. En utilisant des méthodes sans séquençage, Hopkins et al. ont observé que les patients âgés atteints d'ICD présentaient un nombre plus élevé d'entérobactéries (protéobactéries), Entérocoque, et Lactobacilles (les deux Firmicutes), alors que les patients âgés en bonne santé abritaient des Bactéroïdes souches (Bacteroidetes) (61). Les adultes en bonne santé étaient également plus susceptibles d'avoir plus Bifidobactéries et Bactéroïdes par rapport à l'une ou l'autre population âgée. Des études plus récentes utilisant le séquençage à haut débit du gène de l'ARNr 16S ont fourni un examen plus approfondi de la structure de la communauté dans C. difficile–personnes séropositives ( 62 – 64 ). Dans une cohorte de patients âgés, Rea et al. ont observé que les patients atteints d'ICD active abritaient un microbiote intestinal moins diversifié que leurs homologues sains (63). Des augmentations des Lactobacillaceae et des Enterobacteriaceae, mais des diminutions des Enterococcaceae, ont été observées chez les patients positifs pour C. difficile. Des résultats similaires ont été rapportés dans des études comparant des adultes en bonne santé avec des patients souffrant de diarrhée à la fois CDI et non-CDI (64, 65). Par rapport aux adultes en bonne santé, les deux groupes avaient des communautés significativement moins diversifiées, en particulier une population Firmicutes moins diversifiée. Les familles Lachnospiraceae, Ruminococcaceae et Bacteroidaceae dominaient les communautés observées chez les personnes en bonne santé. Fait intéressant, les patients non-CDI et CDI atteints de diarrhée active avaient des communautés étonnamment similaires, ce qui suggère que la diarrhée ou l'inflammation elle-même peut être corrélée à une communauté de microbiote particulière. De plus, la plupart des échantillons de CDI ont été collectés tout au long de l'utilisation des antibiotiques, ce qui peut simplifier la structure communautaire observée. Bien que les résultats de différentes études soient concordants, les différences interindividuelles dans le microbiote intestinal à travers les études sont apparentes. Les facteurs de l'hôte et les influences environnementales sur le microbiote intestinal et la maladie elle-même compliquent l'identification de marqueurs microbiens spécifiques responsables de la protection contre la maladie.

Résumé des taxons microbiens protecteurs observés (négativement corrélés à C. difficile colonisation) et des taxons microbiens sensibles (corrélés positivement à C. difficile colonisation) dans des études humaines examinant les changements dans la communauté du microbiote et le CDI

Des observations générales similaires ont été faites dans des modèles murins, dans lesquels les variances environnementales et génétiques peuvent être mieux contrôlées. Comme chez l'homme, l'administration d'antibiotiques diminue la diversité du microbiote intestinal chez les souris, les rendant plus sensibles à de multiples maladies entériques, y compris l'ICD. Lawley et al. ont observé qu'une diversité microbienne réduite dans l'intestin de la souris, dominée par Entérocoques et les protéobactéries, à la suite d'une maladie induite par un traitement à la clindamycine et de l'excrétion de spores contagieuses (66). Un autre modèle de CDI basé sur la clindamycine chez la souris a signalé des diminutions similaires des membres des entérobactéries, ainsi que des différences dans la récupération des communautés avec et sans CDI (67). Reeves et al. ont constaté que les souris sensibles étaient dominées par les familles Lactobacillaceae et Enterobacteriaceae avant l'infection après un traitement avec de la céfopérazone, de la clindamycine ou un cocktail multi-antibiotiques (68). À l'inverse, les membres de Lachnospiraceae dominaient les animaux qui restaient résistants au CDI. Une étude de suivi basée sur ces observations a observé que les souris colonisées par des isolats de Lachnospiraceae, mais pas celles colonisées par E. coli isolats, présentaient une diminution C. difficile colonisation et maladie moins grave (69). Malgré des différences à des niveaux taxonomiques inférieurs dans le microbiote intestinal entre les humains et les souris, les modèles murins ont fourni un moyen plus testable d'identifier les composants protecteurs dans le développement de CDI.

L'une des difficultés qui ont entravé l'identification des membres spécifiques de la communauté qui confèrent une résistance à la colonisation est la variabilité interindividuelle inhérente du microbiote observé dans la population humaine. De plus, l'identification d'un même type de microbe ne garantit pas que le microbe aura une fonction génétique identique, pas plus que l'identification de microbes différents n'exclut la possibilité de fonctions similaires au sein d'une communauté. Au lieu de cela, des études récentes ont proposé que l'environnement métabolique, ou fonctionnel, peut être plus révélateur d'états sensibles par rapport à la structure de la communauté. Une étude récente de Theriot et al. suggère que les changements induits par les antibiotiques qui rendent les souris sensibles C. difficile sont mieux reflétés en termes de changements métaboliques plutôt que de changements dans la composition de la communauté microbienne (25). Bien que les souris traitées aux antibiotiques aient finalement récupéré la résistance à la colonisation, la composition de leur communauté a été modifiée par rapport à leur communauté préantibiotique, suggérant que les changements fonctionnels plutôt que les changements de la communauté sont importants pour maintenir la résistance au CDI. D'autres études sur la façon dont différentes communautés peuvent fournir des fonctions similaires seront nécessaires pour élucider la relation structure-fonction du microbiome pendant l'infection.

Une préoccupation majeure dans le traitement de l'ICD est la récurrence de la maladie après une réponse apparemment réussie à un traitement standard composé d'antibiotiques connus pour supprimer la croissance de C. difficile, métronidazole et/ou vancomycine. On estime que la récidive survient chez 20 à 30 % des patients atteints d'ICD après chaque incidence, le risque de récidive augmente (70). Bien que l'on ne sache pas pourquoi la récidive se produit chez certains patients et pas chez d'autres, les facteurs de risque d'ICD récurrente incluent l'utilisation d'antibiotiques non CDI après un épisode initial, ainsi que l'âge et la gravité de la maladie (71). Il est émis l'hypothèse que le traitement antibiotique interfère avec la capacité du microbiote intestinal à se rétablir complètement et à rétablir la résistance à la colonisation chez certains individus. Alternativement, la récurrence pourrait refléter l'échec de l'hôte à monter une réponse immunitaire protectrice contre C. difficile.

Peu d'études ont étudié les signatures structurelles dans le microbiome qui conduisent potentiellement à une récidive. La plupart des études d'ICD humaines n'ont pas inclus d'aspect longitudinal à leurs études ou n'ont pas distingué les patients atteints d'ICD récurrentes multiples. Chang et al. ont observé que la communauté du microbiote était moins diversifiée chez les patients récurrents que chez ceux avec un seul cas d'ICD, suggérant que la récurrence pouvait être prédite sur la base de la communauté du microbiote présente lors de l'infection (72). While some studies comparing non-CDI and CDI samples have included secondary recurrent samples in their analysis, none were able to identify particular aspects unique to patients with recurrent CDI ( 63 ).

Interestingly, much of our knowledge about the microbiota during recurrent CDI comes from an alternative treatment method, fecal microbiota transplantation (FMT). Use of FMT, or fecal bacteriotherapy, has become a popular, highly effective treatment method for recurrent CDI. The success rate of FMT is up to 92% in multiply recurrent CDI patients, depending on the protocol used ( 73 ). It is presumed that FMT is capable of restoring the microbiota and colonization resistance. However, as with the identification of which specific microbes may indicate susceptibility to CDI, the microbes responsible for restoring colonization resistance have not been specifically identified. Earlier studies using either culture-based or PCR-based methods have reported the recovery of Bactéroïdes species and detection of more Firmicutes in culture, only after the FMT procedure, along with successful clinical recovery ( 74 , 75 ). Recent studies using 16S rRNA surveys have observed that after FMT, diversity of the gut microbiota increases and resembles the donor’s ( 76 – 78 ). Recovery of both Firmicutes and Bactéroïdes a été observé. Additionally, the level of Proteobacteria, generally found at high levels within patients with active CDI, decreases after FMT. Interestingly, the dominant donor microbes classified at either at the genus level or the operational taxonomic unit level are observed to be prevalent within the recipient for only days following FMT ( 77 , 79 ). The microbes that are found to be dominant within recipients in the long term appear to be recipient-specific, even if the community is more similar to the donor’s than before FMT. These observations suggest that direct colonization by the donor’s microbes is not necessarily what accounts for recovery of the microbiota community following FMT.

As with the identification of communities that render an individual more susceptible to C. difficile during initial infection, the functional state of the environment may be more telling than the structure. Indeed, human microbiome studies of CDI have observed a decrease in butyrate-producing microbial taxa and have postulated that the abundance of microbial by-products, such as short-chain fatty acids, may be indicative of susceptibility to CDI ( 64 , 80 , 81 ). A recent study by Weingarden et al. observed high concentrations of primary bile acids in patients with recurrent CDI ( 27 ). Following FMT, the concentration of secondary bile acids, undetected in pre-FMT samples, was increased and was found at a relative abundance close to that of healthy donors. These results are in agreement with the in vitro and in vivo mouse studies that have previously observed that secondary bile acids, such as lithocholic or deoxycholic acid, inhibit C. difficile growth ( 20 , 25 ). Although the bacterial community is responsible for producing the metabolic environment, it is possible that several types of bacterial communities with similar functions may be capable of the same metabolic outcome, and that structure alone may not be enough to determine recurrence risk ( 82 ).

In addition to standard therapy or FMT, other treatment methods for CDI have been explored. Ideally, therapy would be effective against C. difficile but fail to globally affect the indigenous gut microbiota. Antibiotics other than vancomycin or metronidazole, such as fidaxomicin, tigecycline, and rifampicin, have been used to treat severe or recurrent CDI ( 83 , 84 ). Fidaxomicin was also shown to exert little effect on Bactéroïdes counts, which may be advantageous in preserving colonization resistance ( 85 ). Tigecycline has been observed to inhibit toxin production and growth in mice and has been used to treat severe disease in humans ( 86 , 87 ). However, even antibiotics that have intrinsic capability against C. difficile are able to change the microbiota, potentially resulting in a loss of colonization resistance ( 88 ). The future of CDI treatment will likely include nonantibiotic therapeutic approaches against CDI, which are advantageous since they may be less likely to perturb the microbiota in a detrimental manner. One option is to treat the primary cause of disease development in CDI, toxin activity by toxins A and B. Serum IgG antibodies against toxins A and B have been correlated with protection in human studies ( 89 , 90 ). Both passive and active immunization strategies against toxins have been explored as potential methods to treat C. difficile ( 91 ). Drugs that bind toxin in vitro, such as tolevamer, have also been used in human trials, but with limited success ( 92 ). Although antitoxin therapies may prevent the effects of toxin and disease development, they do not prevent C. difficile colonization or potential spore transmission.

Like FMT, therapies involving live microorganisms have great promise in CDI treatment and prevention. Synthetic mixes of bacteria have been suggested as potential biotherapeutic approaches to treating CDI as an alternative to fecal transplantation directly from a donor. Although donors are generally screened for known pathogens before FMT, there is still a risk of transmission of unknown pathogens or unknown risks associated with the microbiota. A synthetic mix provides control over many safety issues compared with direct fecal matter, such as reducing the potential risk of pathogen transmission and providing more reproducible control over the types of bacteria contained in the mixture. Lawley et al. were able to identify a population of 6 different bacteria that were efficient at clearing CDI in mice ( 93 ). In humans, Petrof et al. reported successful treatment of recurrent CDI in 2 patients with a community consisting of 33 isolates from a healthy donor ( 94 ). Furthermore, if the functional aspects rather than the community itself can lead to colonization resistance, formulation of an effective biotherapeutic option may include organisms that are capable of providing a metabolic environment that promotes the growth of existing healthy microbes, such as Bactéroïdes or Firmicutes, rather than fully replacing the community favorable to C. difficile. These data have generated great interest in creating commercial biotherapeutics to replace FMT, potentially leading to the development of prebiotics or prescribed diets instead of bacterial communities to enhance an environment resistant to C. difficile outgrowth and/or colonization.

The observation that asymptomatically colonized patients have a reduced risk of developing CDI has prompted research into using nontoxigenic strains as preventative therapy against C. difficile ( 95 ). Recently, Nagaro et al. observed that hamsters infected with nontoxigenic strains were protected from infection with the hyperendemic BI/NAP1/027 strain, which is usually 100% fatal in hamsters ( 96 ). Nontoxigenic strains have also been used safely in studies of volunteer patients in prevention of recurrent C. difficile ( 97 ). Both the generation of a protective immune response by the host and competitive niche theories have been hypothesized to explain these results. However, the potential for gene transfer of virulence factors and antibiotic resistance among nontoxigenic and toxigenic strains is a concern.

Although a basic picture of CDI pathogenesis is known, a better understanding of the microbiota’s role in disease prevention is necessary. The role of the gut microbiota is integral throughout the life cycle of C. difficile from spore transmission, germination, and growth, into disease development. Although our understanding about the complexity of disease development and transmission has improved in recent decades, we still lack knowledge on which components are crucial points of interruption. The development of future therapeutics to treat disease and minimize transmission depends on expanding our current knowledge.

The NIH grant U19AI090871 (to V.B. Young) and the Michigan Gastrointestinal Peptide Research Center (P30DK034933) provided funding for this research. We thank Mark Mazaitis for his consultation on the figure concepts.

Conflit d'intérêt: Les auteurs ont déclaré qu'il n'existe aucun conflit d'intérêts.

Informations de référence: J Clin Invest. 2014124(10):4182–4189. doi:10.1172/JCI72336.


Résumé

Clostridium difficile is now considered to be one of the most important causes of health care-associated infections. C. difficile infections are also emerging in the community and in animals used for food, and are no longer viewed simply as unpleasant complications that follow antibiotic therapy. Since 2001, the prevalence and severity of C. difficile infection has increased significantly, which has led to increased research interest and the discovery of new virulence factors, and has expanded and focused the development of new treatment and prevention regimens. This Review summarizes the recent epidemiological changes in C. difficile infection, our current knowledge of C. difficile virulence factors and the clinical outcomes of C. difficile infection.


The increased incidence and severity of Clostridium difficile infection (CDI) in older adults (age, ⩾65 years) corresponds with the emergence of the BI/NAP1 strain, making elucidation of the host immune response extremely important. We therefore infected germ-free C57BL/6 mice aged 7–14 months with a BI/NAP1 strain and monitored the mice for response. Infected mice were moribund 48–72 h after infection and developed gross and histological cecitis and colitis and elevated concentrations of keratinocyte chemoattractant, interleukin 1β, monocyte chemotactic protein 1, and granulocyte colony-stimulating factor and decreased levels of interferon γ, interleukin 12 p40, interleukin 12 p70, and interleukin 10 compared with controls. We conclude that aged, germ-free C57BL/6 mice are susceptible to fulminant CDI from a BI/NAP1 strain and represent a novel model to further elucidate the host immune response to acute CDI.

The incidence, severity, and mortality of Clostridium difficile infection (CDI) have increased, especially in individuals ⩾65 years of age, possibly in association with the emergence of the epidemic restriction endonuclease analysis and pulse field gel electrophoresis BI/NAP1 strain [ 1]. This strain has been present since the 1980s but was not previously responsible for outbreaks 2]. It hyperproduces toxins A and B, secretes a binary toxin, hypersporulates, and has developed high-level fluoroquinolone resistance, which suggests that these traits have led to increased virulence and spread [ 2].

A murine model of infection is extremely important to help elucidate the host immune response to CDI and to better understand the pathogenesis induced by BI/NAP1 as well as additional C. difficile souches. The traditional animal model of CDI, the Syrian hamster, is limited by an inability to study the host cytokine response due to a lack of host-specific reagents. Previous germ-free CDI experiments with murine strains other than C57BL/6, particularly in the 1980s and early 1990s, resulted in minimal intestinal pathogenesis to severe cecal and colon ulceration with 100% mortality [ 3, 4]. The majority of these studies, however, utilized a highly toxigenic laboratory strain, VPI 10463, which has high levels of toxin A and B production, has low sporulation rates, and has never been found to cause human colitis. No gnotobiotic murine studies have been performed with the BI/NAP1 strain, and it has not yet been determined whether germ-free C57BL/6 mice are susceptible to CDI. Additionally, the murine mucosal cytokine response to CDI has not been documented.

Therefore, we undertook this study to determine whether germ-free C57BL/6 mice—a commonly investigated strain that can be bred for transgenic and knockout mouse studies—inoculated with a clinically relevant BI/NAP1 strain could be a beneficial model to study the pathogenesis of and host mucosal cytokine responses to acute CDI.

Méthodes. UVA13, a human-infecting C. difficile isolate that was previously cultured from a fecal specimen from a patient with CDI at the University of Virginia Hospital and typed as BI/NAP1 by the Hines Reference Laboratory at the Hines Veterans Affairs Hospital (Hines, IL) with the use of restriction endonuclease analysis and a protocol that has been described elsewhere [ 5], was inoculated into chopped meat broth and incubated anaerobically at 38°C for 24 h. Sixteen germ-free C57BL/6 mice (age, 7–14 months) from the National Gnotobiotic Rodent Resource Center at the University of North Carolina were orally gavaged with 330 μL of incubated broth containing a total of 1 X 10 8 organisms. Similarly, VPI 11186, a nontoxigenic strain of C. difficile, was incubated in broth for 24 h, and 2 germ-free mice were orally gavaged with 1 X 10 8 organisms. Six germ-free mice received a similar dosage of uninoculated broth and served as uninfected controls. Sterility was confirmed in germ-free mice by aerobic and anaerobic culture and Gram staining of stool samples, as outlined elsewhere [ 6].

Mice were monitored every 8 h after inoculation for clinical signs and symptoms of disease, including diarrhea and impaired physical condition and behavior. Weights were obtained as a measure of disease at the time of euthanasia. Mice that were determined to be moribund according to Animal Care and Use Committee policy and approved protocol were weighed and euthanized. (See Appendix 1, which appears only in the online version of the Journal .)

Cecal and colon segments were collected from euthanized mice and prepared for histological analysis by use of hematoxylin-eosin stain and antibodies directed against myeloperoxidase. Histological specimens were scored by 2 blinded investigators (S.W.P. and R.F.) on a scale of 0–3 (minimal score, 0 maximal score, 3) on the basis of each of the following criteria: inflammatory cell infiltration, mucosal hypertrophy, vascular congestion, epithelial disruption, and submucosal edema. (See Appendix 2, which appears only in the online version of the Journal .)

Cecal and colon segments were homogenized and assayed for the cytokines granulocyte colony-stimulating factor (GCSF), interleukin 1β (IL-1β), keratinocyte chemoattractant (KC), tumor necrosis factor α (TNF-α), interferon γ (IFN-γ), monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1), interleukin 12 p40 (IL-12p40), interleukin 12 p70 (IL-12p70), interleukin 6 (IL6), interleukin 17 (IL-17), interleukin 13 (IL-13), and interleukin 10 (IL-10) by use of bead-based Luminex immunoanalysis (Bio-Rad).

Mean differences in cecal and colon histopathological scores and cytokine levels were analyzed with SPSS software (version 17 SPSS) and evaluated using an independent Student t test. Results for which P⩽ .05 were determined to be significant.

Résultats. All mice given UVA13 died or were moribund (necessitating euthanasia) within 72 h, whereas mice given VPI 11186 or broth were asymptomatic. Germ-free mice administered UVA13 developed diarrhea and/or wet tail, accompanied by weight loss. Eleven (69%) of 16 UVA13-infected mice were euthanized and processed for histological and cytokine analysis (5 UVA13-infected mice died and could not be processed). Broth control mice (N= 6) and mice infected with the nontoxigenic strain (N= 2) were euthanized after 72 h, processed, and assessed for comparison of histological scores and cytokine levels.

In a gross comparison, UVA13-infected mice had shorter ceca than those of controls, with evidence of purulent, hemorrhagic, or loose cecal contents with less pronounced alterations in colon segments. Histopathological scores were significantly higher in UVA13-infected mice than in control mice, with evidence of both cecal and colon ulceration, loss of mucosal architecture, epithelial exfoliation, inflammatory cell in filtration, edema, and hemorrhage in the lamina propria ( Figure 1). Although neutrophilic infiltration was demonstrated with myeloperoxidase staining, it was relatively minor, and there was evidence of myeloperoxidase both within neutrophils and extravasated within the lumen ( Figure 1).

Histopathological analysis of cecal and colon segments 72 h after oral inoculation with 1 X 10 8 colony-forming units of UVA13 (BI/NAP1 [BI] strain of Clostridium difficile), VPI 11186 (nontoxigenic C. difficile strain), or broth. UNE, Hematoxylin-eosin stain of a cecal segment from a germ-free mouse infected with the nontoxigenic strain. B, Hematoxylin-eosin stain of a cecal segment from a germ-free mouse infected with the BI strain. C, Myeloperoxidase stain of a cecal segment from a germ-free mouse infected with the BI strain (brown indicates myeloperoxidase activity). D, Histopathological differences in the cecum and colon between BI-infected mice (N = 11), mice infected with the nontoxigenic strain (N = 2), and broth controls (N = 6) as determined by inflammatory cell infiltration, mucosal hypertrophy, vascular congestion, epithelial disruption, and submucosal edema, with a maximum score of 15. *P ⩽ .001 for BI-infected mice compared with broth controls. L, lumen.

Histopathological analysis of cecal and colon segments 72 h after oral inoculation with 1 X 10 8 colony-forming units of UVA13 (BI/NAP1 [BI] strain of Clostridium difficile), VPI 11186 (nontoxigenic C. difficile strain), or broth. UNE, Hematoxylin-eosin stain of a cecal segment from a germ-free mouse infected with the nontoxigenic strain. B, Hematoxylin-eosin stain of a cecal segment from a germ-free mouse infected with the BI strain. C, Myeloperoxidase stain of a cecal segment from a germ-free mouse infected with the BI strain (brown indicates myeloperoxidase activity). D, Histopathological differences in the cecum and colon between BI-infected mice (N = 11), mice infected with the nontoxigenic strain (N = 2), and broth controls (N = 6) as determined by inflammatory cell infiltration, mucosal hypertrophy, vascular congestion, epithelial disruption, and submucosal edema, with a maximum score of 15. *P ⩽ .001 for BI-infected mice compared with broth controls. L, lumen.

We next examined cecal and colon segments to determine mucosal cytokine concentrations produced after infection. UVA13 infection led to elevated cecal and colonic concentrations of KC, MCP-1, IL-1β, and G-CSF compared with those in controls concentrations were greater in the cecum than in the colon ( Figure 2). Additionally, BI/NAP1 infection led to lower levels of cecal and colonic IL-12p40, IL-12p70, IFN-γ, and IL-10 ( Figure 2). There were no differences in the concentrations of the pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6, IL-13, and IL-17.

Cytokine concentrations in the cecum and colon 72 h after oral inoculation with 1 X 10 8 colony-forming units of UVA13 (BI/NAP1 [BI] strain of Clostridium difficile), VPI 11186 (nontoxigenic strain), or broth. Cecal (UNE) and colon (B) segments were homogenized in a proteinase inhibitor cocktail and assayed for the cytokines granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1), keratinocyte chemoattractant (KC), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 12 p40 (IL-12p40), interleukin 12 p70 (IL-12p70), interferon γ (IFN-γ), interleukin 10 (IL-10), tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 6 (IL-6), interleukin 17 (IL-17), and interleukin 13 (IL-13) by use of Luminex immunoanalysis (Bio-Rad). There were no significant differences in IL-6, IL-17, or IL-13 concentrations between the groups (data not shown). * P⩾ .05 for BI-infected mice (N = 11) compared with broth controls (N = 6) ** P ⩽ .001 for BI-infected mice (N = 11) compared with broth controls (N = 6).

Cytokine concentrations in the cecum and colon 72 h after oral inoculation with 1 X 10 8 colony-forming units of UVA13 (BI/NAP1 [BI] strain of Clostridium difficile), VPI 11186 (nontoxigenic strain), or broth. Cecal (UNE) and colon (B) segments were homogenized in a proteinase inhibitor cocktail and assayed for the cytokines granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1), keratinocyte chemoattractant (KC), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 12 p40 (IL-12p40), interleukin 12 p70 (IL-12p70), interferon γ (IFN-γ), interleukin 10 (IL-10), tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 6 (IL-6), interleukin 17 (IL-17), and interleukin 13 (IL-13) by use of Luminex immunoanalysis (Bio-Rad). There were no significant differences in IL-6, IL-17, or IL-13 concentrations between the groups (data not shown). * P⩾ .05 for BI-infected mice (N = 11) compared with broth controls (N = 6) ** P ⩽ .001 for BI-infected mice (N = 11) compared with broth controls (N = 6).

Discussion. The results of this study indicate that acute infection with a clinically relevant BI/NAP1 C. difficile strain leads to weight loss, symptomatic disease, cecal and colonic ulceration, a relatively minor neutrophil infiltration, a measurable cytokine response, and eventual death in monoassociated C57BL/6 mice. The clinical and histopathological findings are in agreement with those of Vernet and colleagues [ 4], who previously observed that germ-free C3H/He mice infected with C. difficile that secreted elevated levels of toxin A in vitro developed cecal and colon ulceration and 100% mortality. The findings of other studies demonstrate that the BI/NAP1 strain hyperproduces toxins A and B in vitro, and those of additional studies, as well as of work in our laboratory, indicate that VPI 10463, which was used in the majority of previous studies involving CDI in germ-free mice, produces even greater levels of toxin A in vitro compared with UVA13 [ 2].

Previous studies of the host cytokine response to toxins A and B have been limited to data from cell culture and small intestinal loops directly exposed to purified toxins A or B, and those studies have shown a predominant inflammatory response to toxin exposure. Binding of the toxins to their respective receptor leads to induction of mitogen-activated protein kinase, translocation of nuclear factor κB into the nucleus, inhibition of the Rho family of proteins, and activation of submucosal neurons, all of which have the effect of activation of pro-inflammatory cytokines, recruitment of neutrophils, epithelial cell apoptosis, and disruption of tight junctions. Not only does toxin exposure lead to the secretion of some pro-inflammatory cytokines, it may also lead to decreased levels of protective cytokines such as transforming growth factor β (TGF-β) [ 7]. We demonstrated increased production of many, but not all, proinflammatory cytokines produced by innate immune cells and epithelial cells, as well as decreased mucosal production of IL-10, another protective cytokine. We did not measure TGF-β concentrations.

The elevations of IL-1β, KC (human interleukin 8 [IL-8] equivalent), and MCP-1 in our study of BI/NAP1 CDI are in agreement with the findings of cell culture and murine intestinal loop studies that show elevations in the same cytokines in response to toxin exposure. Our results are also in agreement with cytokine data in studies of CDI in humans, which show elevated fecal IL-8 levels in patients with clinically severe CDI [ 8]. Similarly, decreased levels of IL-10, which are normally thought to play a role in maintaining the host barrier defense and suppressing inflammation, in our BI/NAP1-infected mice are in agreement with our preliminary data from rabbit intestinal loops showing decreased IL-10 levels after toxin A exposure (C.A.W., oral communication, April 2010). These similarities of cytotoxic profiles further validate the clinical relevance of our model.

Interestingly, there was no difference in the pro-inflammatory cytokine TNF-α, which has previously been shown to be increased in toxin A enteritis [ 9]. In addition, the significantly lower levels of IFN-γ in our severely infected mice are in contrast to those found in studies of small intestinal loops exposed to purified toxin A by Ishida and colleagues [ 9], who hypothesized that IFN-γ is the crucial mediator of toxin-induced enteritis after noting attenuated disease in IFN-γ knockout mice. The interrelationship among cytokines likely explains the low levels of TNF-α, as IFN-γ is partially responsible for TNF-α expression in murine intestinal loops exposed to toxin A [ 9]. Additionally, IL-12, which was significantly lower in our BI/ NAP1-infected mice, has been shown to induce IFN-γ expression in macrophages, T cells, and intestinal loops and therefore may be partially responsible for the low levels of IFN-γ found [ 9–11].

The differences in cytokine expression between our model of CDI and studies involving pure toxin exposure of cell culture and intestinal loops may in part be due to a lack of direct host-pathogen interaction in the latter models. Toxin A-negative, toxin B-positive C. difficile strains lead to severe human CDI despite the limited pathogenesis observed when purified toxin B is inoculated into murine, hamster, and rabbit small intestinal loops [ 5]. On the other hand, purified toxin A within murine, hamster, and rabbit small intestinal loops leads to severe disease. Further lending credence to the importance of the pathogen-host interaction is a recent study indicating that toxin B is responsible for pathogenesis as opposed to toxin A. In this study, Lyras and colleagues [ 12] found that hamsters exposed to a toxin A-positive, toxin B-negative C. difficile showed no evidence of disease, whereas disease was observed in hamsters exposed to a toxin A-negative, toxin B-positive variant. En outre, C. difficile surface layer proteins lead to pro-inflammatory IL-1β and IL-6 secretion, which highlights the importance of host-pathogen recognition and signaling and the interaction of the toxin and the C. difficile -derived components [ 13].

While we were performing our germ-free studies, Chen and colleagues [ 14] discovered a murine model of CDI using conventional C57BL/6 mice, which leads to ulcerative cecitis, colitis, and a moribund state after exposure to 6 antibiotics and VPI 10463, whereas a BI/NAP1 strain given in a similar manner leads to symptomatic disease and cecal and colon pathogenesis, but no mortality. Histological analysis of the cecum and colon of BI/NAP1-infected mice in the study by Chen and colleagues [ 14] demonstrated subcutaneous edema and neutrophilic infiltration but little epithelial disruption, whereas mice given VPI 10463 showed destruction of the host architecture in addition to edema and neutrophil margination, indicating that epithelial disruption is necessary to induce mortality, which is similar to the results found for gnotobiotic mice [ 4, 1 4]. Why the BI/ NAP1 strain was able to induce epithelial destruction and death in our monoassociated mice, as opposed to in the conventional mice in the study by Chen and colleagues [ 14], is unknown, but possibilities include the greater number of organisms used to colonize our mice (1 X 10 8 vs 1 X 10 5 colony-forming units), age-related differences in the host immune response, less developed mucosal responses in germ-free mice, or an influence by the retained host microbiota after antibiotics [ 15]. While microbiota analysis was not performed on fecal pellets before or after exposure to antibiotics, one can hypothesize that exposure to 6 different antibiotics led to decreased normal bacterial concentrations and altered composition, although antibiotics do not induce a sterile state.

We have thus shown that BI/NAP1 CDI in an aged germ-free C57BL/6 mouse leads to symptomatic disease, a moribund state, and profound histopathology in the cecum and colon. Additionally, as a result of CDI, certain cecal and colonic cytokines are produced, which had not previously been documented. Differences in cytokine production between in vivo infection and small intestinal loop studies or in vitro toxin studies highlight the importance of the host-pathogen relationship in CDI. Use of this model in concurrence with other newly established conventional C57BL/6 mouse models will lead to a greater understanding of the host-pathogen interaction and the role of the host microbiota in CDI.


Conclusion

This review shows that dysbiosis is a complicated disorder in the intestinal microbiota, i.e., strongly believed to play a role in the pathogenesis of IBD and other disorders like CRC and allergic disorders however, future work must be done to confirm this hypothesis. Future researchers must also be aware of the various factors, such as genetics, diet, and environmental factors, which impact the formation of gut dysbiosis. Based on this knowledge, along with the continuing work of identifying the gut microbiota present in humans, future researchers should be able to come closer in successfully intervening against dysbiosis and its associated diseases.


Résultats

Caco-2 cell infection with C. difficile

Initial experiments were performed to investigate the viability of Caco-2 cells at 30, 60, and 120 min p.i. MTT assays showed that cell viability was drastically reduced in a time-dependent fashion following infection ( Fig. 1A ). Morphological changes of cells were also examined. Cell disruption and aggregation was observed at 30 min p.i. and became increasingly evident at 60 and 120 min p.i. ( Fig. 1B ).

Infection of Caco-2 cells with C. difficile. (A) Quantification of Caco-2 cell viability at different times post-infection. All assays were conducted in triplicate and repeated independently three times. Cell viability is as expressed as the percentage of survival of the control wells. Results are expressed as means ± 1 standard deviation for the replicate experiments, and the Student t test was used for statistical analysis of the data. Significant difference from the control (p < 0.05) is indicated by an asterisk. Caco-2 cells under anaerobic conditions at different time points without the infection were also evaluated but they were not significantly different from the control cells. (B) Photomicrographs of infected Caco-2 cells with C. difficile at 30, 60 and 120 min post-infection.

Transcriptome of Caco-2 and C. difficile during infection

The global gene expression profiles of Caco-2 cells and C. difficile at 30, 60, and 120 min p.i. were compared with those of uninfected cells. A total of 271 genes in Caco-2 cells and 207 genes in C. difficile were significantly DE in at least one time point during the infection. The numbers of up- and down-regulated genes in Caco-2 cells and C. difficile at each time point are shown in Fig. 2A . We also performed hierarchical clustering of DE genes at each time point ( Fig. 2B and 2C ). The clustered data demonstrate a clear pattern of transcriptional regulation during the infection.

Transcriptional dialogue between Caco-2 cells and C. difficile pendant l'infection. (A) The number of up- or down-regulated genes after 30, 60, and 120 min p.i., as compared to the expression levels at the time of infection. (B, C) Hierarchical clustering analysis of differentially expressed genes in Caco-2 cells and C. difficile pendant l'infection. Genes identified to be significantly differentially expressed at 30, 60 or 120 min in Caco-2 or C. difficile cells p.i. relative to in vitro growth. Genes significantly different with p-value < 0.05 after the infection were pooled and used to create heatmaps for (B) Caco-2 cells, and (C) C. difficile. Genes are ordered in rows, conditions as columns. Red color indicates genes induced post-infection vs. prior to infection (fold change) green color denotes repression.

Functional classes of DE genes and their network interaction

To further characterize the DE genes in Caco-2 cells and C. difficile according to their functional groups, an enrichment analysis based on the biological process categories of the GO database was performed ( Fig. 3 ). For Caco-2 cells, �.9% of the DE transcripts were annotated as being involved in metabolic processes including metabolism of nucleic acids (17.3%), proteins (16.7%), lipids (3%). A significant number of transcripts were assigned known functions in cell organization and biosynthesis (13.9%), transport (11.4%), cell communication (10.5%), signal transduction (9.9%), and transcription (9.3%). Genes associated with cell differentiation (5.7%), cell cycle (4.2%), response to stress (3.2%), cell death (3.0%), and cytoskeleton organization and biogenesis (2.3%) were also differentially expressed during the infection. Similarly, DE genes with metabolic functions in C. difficile were found to be most prevalent (68.0%). Genes involved in transport (18.9%), transcription (17.2%), biosynthesis (16.0%), cell communication (10.2%), signal transduction (10.2%), cell organization and biogenesis (4.1%), and protein modification (2.9%) were also abundant.

Functional annotation of genes in Caco-2 cells and C. difficile, which are differentially expressed between infected and uninfected conditions. All differentially expressed genes were annotated using generic GO-slim for biological process.

To understand the biological interaction between the DE genes, we constructed functional networks using String v.8.1. Network analysis of the DE genes in Caco-2 cells facilitated the identification of genes involved in signal transduction including Rho and Wnt pathways, cytoskeleton, cell cycle, immune response, and cell death. Pour C. difficile, the results revealed a complex network of ribosomal proteins, as well as genes associated with cell envelope biosynthesis, purine biosynthesis, regulatory proteins, two component systems, and phosphotransferase systems.

Validation of microarray data using qRT-PCR

To confirm the microarray results and the involvement of key biological pathways, two sets of 11 DE genes as well as one house-keeping gene each from Caco-2 cells and C. difficile were selected for qRT-PCR (See Supplementary Table S1). Although the differences in gene expression appeared to be underestimated in the microarray results, overall the expression ratios obtained by microarray and qRT-PCR analyses were consistent, with a correlation coefficient (R 2 ) of 0.869 ( Fig. 4 ).

Validation of microarray data by qRT-PCR. Gene expression changes in infected versus uninfected cells measured by microarray analysis or qRT-PCR are compared. Data are plotted as log2 ratios of microarray data (x-axis) compared to those of qRT-PCR (y-axis).


DISCUSSION

We previously demonstrated that coprisin analogue has antibacterial activity against various pathogenic bacterial species (13). Here, we assessed whether this peptide had antibiotic activity against C. difficile, the primary etiologic agent of antibiotic-associated pseudomembranous colitis and severe diarrhea in humans and animals (4, 16�, 22). Our results revealed that coprisin analogue treatment significantly inhibited the growth rate of C. difficile ( Fig. 1 ) but did not alter the growth rates of Lactobacilles et Bifidobactérie ( Fig. 2 ). Given that normal microbiota (46), along with probiotics, have inhibitory activities against pathogenic bacteria (3) and that effective antibiotics should have specific antimicrobial activity against pathogenic but not nonpathogenic microbes, coprisin analogue may be a good candidate for use as a potential therapeutic reagent for C. difficile-associated acute colitis.

Although antibiotic-associated diarrhea has been linked to numerous antibiotics, including the beta-lactam antibiotics (26), clindamycin, which is usually used to treat anaerobic bacterial infections, is considered to be a primary cause of C. difficile-associated diarrhea and pseudomembranous colitis (16, 17). Here, we found that clindamycin treatment markedly inhibited the growth of the tested Lactobacilles espèce (L. casei et L. delbrueckii subsp. lactis), as well as Bifidobactérie et C. difficile. This nonselective antibiotic activity against normal microbiota, which can inhibit the growth of pathogenic bacteria, may facilitate C. difficile colonization and subsequent damage. Compared to vancomycin, which has antimicrobial activity against Bifidobactérie mais non Lactobacilles species ( Fig. 2 ), coprisin analogue is more selective and does not appear to have antibiotic activity against the tested normal gut microorganisms.

The amino acid sequence of coprisin is very similar to that of the �-amino-acid defensin and defensin-like peptides, which confer antibacterial activity by disrupting the membrane or suppressing cell cycle signaling (48). In the current study, we found that coprisin analogue treatment damaged the plasma membrane of C. difficile but not that of Bifidobactérie sp. ( Fig. 3C and D). Since both of those bacterial species are Gram positive and since they have biologically similar membranes (3), future work would be necessary to determine the basis for the selective antimicrobial activity of coprisin analogue. For example, a specific receptor for coprisin analogue may exist on the plasma membrane of C. difficile, or negatively charged components of the lipid membrane, such as teichoic acids (30) and peptidoglycan (30), may play a role in the interaction with coprisin analogue. Alternatively, the selectivity of coprisin analogue may arise as a result of the presence of three positively charged amino acids (NH2-RKK-COOH) at the C terminus of the peptide. The defensin family peptides can interact with a wide variety of membrane components, including lipopolysaccharides (41), cardiolipin (11), and sphingolipids (44) beyond those interactions, structural features of the peptides further determine their specificity for binding to the surface of a given microorganism (e.g., via disulfide cross-linking through a cysteine) (7). Since coprisin analogue contains a cysteine in the middle position, potentially allowing it to dimerize, the peptide structure itself may affect its microbial binding capacity or selectivity.

In a mouse model of acute gut inflammation following C. difficile infection, the presence of coprisin analogue markedly ameliorated inflammatory responses and weight loss and improved survival rates. The sharp decreases in body weight on days 2 and 3 following C. difficile infection were only partially reversed by coprisin analogue treatment it was not until day 4 that coprisin analogue-treated mice returned to control-level body weights. However, coprisin analogue did not prevent inflammation resulting from injection of purified toxin A into the ileal lumen (data not shown), suggesting that the apparent anti-inflammatory activity of coprisin analogue is associated with its antimicrobial activity rather than with inhibition of the activity of the toxins.

In summary, we report that coprisin analogue, a disulfide dimer and insect-derived peptide, has selective antibiotic activity against C. difficile mais non Lactobacilles et Bifidobactérie, members of the normal bowel flora. Furthermore, coprisin treatment has a strong beneficial effect on C. difficile infection-induced mouse gut inflammation. These novel findings suggest that coprisin could be a useful candidate for therapeutic use against C. difficile-associated diarrhea and pseudomembranous colitis.