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3.4 : Réparation de l'ADN - Biologie

3.4 : Réparation de l'ADN - Biologie


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Maintien de l'intégrité des informations de la cellule : réparation de l'ADN

Dans la dernière section, nous avons examiné les façons dont les cellules font face aux défis associés à la réplication de leur ADN, un processus vital pour toutes les cellules. Bien que la relecture par les ADN polymérases augmente considérablement la précision de la réplication, il existe des mécanismes supplémentaires dans les cellules pour garantir davantage que l'ADN nouvellement répliqué est une copie fidèle de l'original, et également pour réparer les dommages causés à l'ADN pendant la vie normale d'une cellule.

Tout l'ADN subit des dommages au fil du temps, dus à l'exposition aux rayons ultraviolets et autres, ainsi qu'à divers produits chimiques dans l'environnement. Même les réactions chimiques se produisant naturellement dans les cellules peuvent donner naissance à des composés qui peuvent endommager l'ADN. Comme vous le savez déjà, même des modifications mineures de la séquence d'ADN, telles que des mutations ponctuelles, peuvent parfois avoir des conséquences de grande envergure. De même, les dommages non réparés causés par les radiations, les produits chimiques environnementaux ou même la chimie cellulaire normale peuvent interférer avec la transmission précise des informations dans l'ADN. Le maintien de l'intégrité du « plan » de la cellule est d'une importance vitale et cela se reflète dans les nombreux mécanismes qui existent pour réparer les erreurs et les dommages de l'ADN.

Réparation de non-concordance post-réplicative

Nous avons discuté précédemment de la relecture par les ADN polymérases pendant la réplication. La relecture élimine-t-elle toutes les erreurs commises lors de la réplication. Non. Alors que la relecture réduit considérablement le taux d'erreur, toutes les erreurs ne sont pas corrigées à la volée par les ADN polymérases. Quels mécanismes existent pour corriger les erreurs de réplication qui sont manquées par la fonction de relecture des ADN polymérases.

Les erreurs qui glissent lors de la relecture lors de la réplication peuvent être corrigées par un mécanisme appelé réparation des mésappariements. Alors que le taux d'erreur de réplication de l'ADN est d'environ un nucléotide sur (10^7) en l'absence de réparation des mésappariements, il est encore réduit de cent fois à un nucléotides sur )10^9) lorsque la réparation des mésappariements est fonctionnelle .

Quelles sont les tâches auxquelles un système de réparation de discordance est confronté. Il doit:

  • Scannez l'ADN nouvellement fabriqué pour voir s'il y a des bases mal appariées (par exemple, un G associé à un T)
  • Identifiez et découpez la région du décalage.
  • Remplissez correctement l'espace créé par l'excision de la région de mésappariement.

Il est important de noter que le système de réparation des mésappariements doit disposer d'un moyen de distinguer le brin d'ADN nouvellement créé du brin matrice, si les erreurs de réplication doivent être corrigées correctement. En d'autres termes, lorsque le système de réparation des mésappariements rencontre un mésappariement A-G, par exemple, il doit savoir si le A doit être supprimé et remplacé par un C ou si le G doit être supprimé et remplacé par un T.

La réparation des mésappariements a été bien étudiée chez les bactéries et les protéines impliquées ont été identifiées. Les eucaryotes ont un système de réparation des mésappariements qui répare non seulement les mésappariements d'une seule base, mais aussi les insertions et les suppressions. Chez les bactéries, les protéines de réparation des mésappariements sont codées par un groupe de gènes connus collectivement sous le nom de gènes mut. Certains des composants les plus importants de la machinerie de réparation des mésappariements sont les protéines MutS, L et H. MutS agit pour reconnaître le mésappariement, tandis que MutL et MutH sont recrutés sur le site de mésappariement par la liaison de Mut S, pour aider à découper la région contenant le décalage. Une ADN polymérase et une ligase comblent le vide et rejoignent les extrémités, respectivement.

Mais comment le système de réparation des mésappariements fait-il la distinction entre les brins d'ADN d'origine et les nouveaux ? Chez les bactéries, l'existence d'un système qui méthyle l'ADN au niveau des séquences GATC est la solution à ce problème. E. coli a une enzyme qui ajoute des groupes méthyle sur les adénines dans les séquences GATC. L'ADN nouvellement répliqué est dépourvu de cette méthylation et peut donc être distingué du brin matrice, qui est méthylé. Dans la figure (PageIndex{2}), le brin modèle représenté en jaune est méthylé au niveau des séquences GATC. Les protéines de réparation des mésappariements remplacent sélectivement le brin manquant de méthylation, représenté en bleu sur la figure, garantissant ainsi que ce sont les erreurs dans le brin nouvellement créé qui sont supprimées et remplacées. Parce que la méthylation est le critère qui permet au système de réparation des mésappariements de choisir le brin qui est réparé, le système de réparation des mésappariements bactérien est décrit comme étant dirigé par le méthyle.

Les cellules eucaryotes n'utilisent pas ce mécanisme pour distinguer le nouveau brin de la matrice, et on ne comprend pas encore comment le système de réparation des mésappariements chez les eucaryotes « sait » quel brin réparer.

Systèmes pour réparer les dommages causés à l'ADN

Dans la section précédente, nous avons discuté des erreurs commises lors de la copie de l'ADN, où la mauvaise base est insérée lors de la synthèse du nouveau brin. Mais même l'ADN qui n'est pas répliqué peut être endommagé ou muté. Ces types de dommages ne sont pas associés à la réplication de l'ADN, ils peuvent plutôt survenir à tout moment.

Qu'est-ce qui cause des dommages à l'ADN? Certaines causes majeures de dommages à l'ADN sont :

  • Rayonnement (par exemple, rayons UV au soleil, dans les cabines de bronzage)
  • Exposition à des produits chimiques nocifs (tels que le benzopyrène dans les gaz d'échappement des voitures et la fumée de cigarette)
  • Réactions chimiques au sein de la cellule (telles que la désamination de la cytosine pour donner l'uracile).

Cela signifie que l'ADN de vos cellules est vulnérable aux dommages causés simplement par des actions normales, telles que marcher à l'extérieur, être dans la circulation ou des transformations chimiques se produisant dans chaque cellule dans le cadre de ses activités quotidiennes. (Naturellement, les dommages sont bien pires dans les situations où l'exposition aux radiations ou aux produits chimiques nocifs est plus importante, comme lorsque les gens utilisent à plusieurs reprises des lits de bronzage ou fument.)

Quels types de dommages ces agents causent-ils? Les radiations peuvent causer différents types de dommages à l'ADN. Parfois, comme pour la plupart des dommages causés par les rayons UV, deux bases pyrimidiques adjacentes dans l'ADN seront réticulées pour former des dimères pyrimidiques (notez que nous parlons de deux bases pyrimidiques voisines sur le même brin d'ADN). Ceci est illustré dans la figure de la page précédente où deux thymines adjacentes sur un seul brin d'ADN sont réticulées pour former un dimère de thymine. Les radiations peuvent également provoquer des ruptures dans l'épine dorsale de l'ADN.

Des produits chimiques comme le benzopyrène peuvent se fixer sur des bases, formant des adduits d'ADN volumineux dans lesquels de grands groupes chimiques sont liés aux bases de l'ADN. La formation d'adduits chimiques peut déformer physiquement l'hélice d'ADN, ce qui rend difficile pour les ADN et ARN polymérases de copier ces régions d'ADN.

Les réactions chimiques qui se produisent dans les cellules peuvent entraîner la désamine des cytosines de l'ADN en uracile, comme le montre la figure (PageIndex{3}).

D'autres types de dommages dans cette catégorie incluent la formation de bases oxydées comme la 8-oxo-guanine. Ceux-ci ne modifient pas réellement la structure physique de l'hélice d'ADN, mais ils peuvent causer des problèmes car l'uracile et la 8-oxo-guanine s'apparient avec des bases différentes de celles de la cytosine ou de la guanine d'origine, entraînant des mutations lors du prochain cycle de réplication.

Comment les cellules réparent-elles de tels dommages ? Les cellules ont plusieurs façons d'éliminer les types de dommages décrits ci-dessus, la réparation par excision étant une stratégie courante. La réparation par excision est un terme général pour la découpe et la re-synthèse de la région endommagée de l'ADN. Il existe plusieurs types de réparation par excision :

Réparation par excision de nucléotides (NER)

Ce système répare les dommages causés par les produits chimiques ainsi que les dommages causés par les UV. Comme le montre la figure de la page précédente, dans la réparation par excision de nucléotides, le dommage est reconnu et une coupure est faite de chaque côté de la région endommagée par une enzyme appelée excinucléase (en vert). Une courte portion du brin d'ADN contenant les dommages est ensuite retirée et une ADN polymérase comble le vide avec les nucléotides appropriés. L'ADN nouvellement fabriqué est joint au reste du squelette d'ADN par l'enzyme ADN ligase. Chez E. coli, la NER est réalisée par un groupe de protéines codées par les gènes uvrABC. Comme vous pouvez le voir, NER est similaire, en principe, à la réparation des mésappariements. Cependant, dans le NER, la distorsion de l'hélice, causée par les dommages à l'ADN, indique clairement quel brin de l'ADN doit être retiré et remplacé.

Réparation par excision de base (BER)

Le BER traite des situations telles que la désamination de la cytosine en uracile. Comme indiqué précédemment, les cytosines de l'ADN subissent parfois une désamination pour former l'uracile de base.

Étant donné que les cytosines s'apparient aux guanines et les uraciles à l'adénine, la conversion de la cytosine en uracile dans l'ADN conduirait à l'insertion d'un A dans le brin nouvellement répliqué au lieu du G qui aurait dû passer en face d'un C. Pour éviter cela de se produire, les uraciles sont retirés de l'ADN par réparation par excision de base.

Dans la réparation par excision de base, une seule base est d'abord retirée de l'ADN, suivie de l'élimination d'une région de l'ADN entourant la base manquante. L'écart est alors réparé.

L'élimination de l'uracile de l'ADN est accomplie par l'enzyme uracile ADN glycosylase, qui rompt la liaison entre l'uracile et le sucre dans le nucléotide.

L'élimination de la base d'uracile crée un espace appelé site apyrimidinique (site AP). La présence du site AP déclenche l'activité d'une endonucléase AP qui coupe le squelette de l'ADN.

Une courte région de l'ADN entourant le site de l'uracile d'origine est ensuite retirée et remplacée.


Biologie cellulaire moléculaire

S. Sharma , S.C. Raghavan , dans Encyclopédie de biologie cellulaire , 2016

Résumé

Le maintien de l'intégrité génomique est impératif pour la survie d'un organisme. Parmi les différents dommages à l'ADN, les cassures double brin (DSB) sont considérées comme les plus délétères car elles peuvent entraîner la mort cellulaire si elles ne sont pas réparées ou des réarrangements chromosomiques lorsqu'ils sont mal réparés, conduisant au cancer. La jonction d'extrémités d'ADN non homologues (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR) sont les principales voies de réparation des DSB chez les eucaryotes supérieurs. La RH étant un mécanisme précis, elle utilise une homologie étendue, tandis que la NHEJ est sujette aux erreurs car elle n'utilise aucune homologie ou une homologie limitée. NHEJ est un mécanisme de réparation rapide et fonctionne tout au long du cycle cellulaire. Au cours de la NHEJ, l'hétérodimère de la protéine KU est recruté aux extrémités de l'ADN, suivi par l'ADN-PKcs en association avec ARTEMIS, qui traite les DSB. Pol μ et/ou remplit ces extrémités, si nécessaire, suivi d'une ligature à l'aide du complexe XLF-XRCC4-DNA Ligase IV. Une autre voie de réparation connue sous le nom de NHEJ alternatif (A-NHEJ) ou NHEJ de sauvegarde répare les DSB lorsque les protéines clés responsables de la NHEJ classique sont absentes ou défectueuses. Le choix de la voie de réparation DSB entre NHEJ et HR dépend du cycle cellulaire, de la résection finale et de la structure finale du DSB, qui activent en outre divers capteurs de dommages à l'ADN. Récemment, il a été démontré que la dérégulation de la réparation des DSB constitue une menace pour l'intégrité génomique et peut donc être utilisée comme cible thérapeutique dans le traitement du cancer.


Le cGAS nucléaire supprime la réparation de l'ADN et favorise la tumorigenèse

La réparation précise des cassures double brin de l'ADN par recombinaison homologue préserve l'intégrité du génome et inhibe la tumorigenèse. Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) est un capteur d'ADN cytosolique qui active l'immunité innée en initiant la cascade de signalisation IFN STING-IRF3-type I 1,2. La reconnaissance des micronoyaux rompus par le cGAS relie l'instabilité du génome à la réponse immunitaire innée 3,4, mais l'implication potentielle du cGAS dans la réparation de l'ADN reste inconnue. Ici, nous démontrons que cGAS inhibe la recombinaison homologue dans les modèles murins et humains. Les dommages à l'ADN induisent une translocation nucléaire du cGAS d'une manière qui dépend de l'importine-α, et la phosphorylation du cGAS au niveau de la tyrosine 215 médiée par la tyrosine kinase lymphoïde B facilite la rétention cytosolique du cGAS. Dans le noyau, le cGAS est recruté pour les cassures double brin et interagit avec PARP1 via le poly(ADP-ribose). L'interaction cGAS-PARP1 empêche la formation du complexe PARP1-Timeless et supprime ainsi la recombinaison homologue. Nous montrons que le knockdown de cGAS supprime les dommages à l'ADN et inhibe la croissance tumorale à la fois in vitro et in vivo. Nous concluons que le cGAS nucléaire supprime la réparation médiée par la recombinaison homologue et favorise la croissance tumorale, et que le cGAS représente donc une cible potentielle pour la prévention et le traitement du cancer.


Réplication de l'ADN : Notes sur la réplication, la réparation et la recombinaison de l'ADN

La réplication de l'ADN est une fonction autocatalytique de l'ADN. Il se produit généralement pendant la phase S du cycle cellulaire lorsque les chromosomes sont sous une forme très étendue. Comme proposé par Watson et Crick, la réplication de l'ADN est semi-conservatrice.

Dans la réplication semi-conservatrice, les deux brins se sépareraient l'un de l'autre, conserveraient leur intégrité et chacun synthétiserait, à partir du pool de nucléotides, son brin complémentaire. Le résultat serait que la molécule nouvellement synthétisée porterait ou conserverait l'un des deux brins de la molécule mère et que l'autre brin serait nouvellement assemblé. Il existe suffisamment de preuves pour prouver que l'ADN double brin se réplique réellement par une méthode semi-conservatrice.

Expérience de Meselson et Stahl's (1958):

Ces travailleurs ont cultivé Escherichia coli dans un milieu contenant 15 isotopes N. Après que ceux-ci se soient répliqués pendant quelques générations dans ce milieu, les deux brins de cet ADN contenaient 15 N comme constituants des purines et des pyrimidines. Lorsque ces bactéries à 15 N ont été transférées dans un milieu de culture contenant du 14 N, il a été constaté que l'ADN séparé de la nouvelle génération de bactéries possède un brin plus lourd que l'autre.

Le brin le plus lourd représente le brin parental et le plus léger est le nouveau synthétisé à partir du milieu de culture, indiquant ainsi une méthode semi-conservatrice de réplication de l'ADN et excluant les modèles conservateurs et dispersifs de la synthèse et de la réplication de l'ADN.

La réplication conservatrice ne produirait aucune molécule d'ADN avec une constitution « hybride ». Si la réplication était dispersive, il y aurait eu un déplacement de l'ADN de "lourd vers "léger" à chaque génération.

Des études ultérieures ont vérifié la conclusion de Meselson et Stahl selon laquelle la réplication de l'ADN est semi-conservatrice et l'ont étendue à de nombreux autres organismes, y compris les plantes et les animaux supérieurs.

Expérience d'autoradiographie de Cairn :

Il a utilisé de la thymine radioactive ou de la thymidine tritiée. En cultivant E. coli dans un milieu de culture contenant de la thymidine tritiée, la radioactivité a été incorporée dans les molécules d'ADN filles.

Dans l'autoradiographie, la molécule d'ADN en double montre une fourche de réplication, le point auquel deux chaînes deviennent quatre. Après la première réplication, la radioactivité s'avère être incorporée dans un seul des brins d'ADN et les deux brins s'avèrent marqués après la seconde réplication. Cela prend en charge les modes semi-conservateurs de réplication de l'ADN.

J.H. Taylor’s des expériences sur des pointes de racines de Viciafaba (1957) confirment également la méthode semi-conservatrice de réplication de l'ADN.

je. Réplication discontinue de l'ADN :

Okazaki a suggéré que la synthèse d'ADN se déroule simultanément sur les deux brins d'ADN en utilisant la même enzyme ADN poly­merase sous la forme de petits fragments isolés. Ces segments sont connus sous le nom de morceaux d'Okazaki et se composent de 1 000 à 2 000 nucléotides. Ceux-ci sont reliés entre eux par l'enzyme polynucléotide ligase, complétant la formation de la chaîne polynucléotidique et shyotide.

La synthèse discontinue de l'ADN est soutenue par l'expérience auto-radiographique.

ii. Réplication unidirectionnelle et bidirectionnelle de l'ADN :

J. Cairns de ses expériences a conclu que la synthèse d'ADN commence à un point fixe sur les chromosomes et procède dans une direction, mais des expériences récentes suggèrent une réplication bidirectionnelle.

Levinthal et Cairns ont proposé que pendant la réplication, les deux brins ne se séparent pas complètement avant la réplication. Au lieu de cela, ils commencent à se décompresser à une extrémité et simultanément les segments non compressés commencent à attirer leurs paires de nucléotides. De cette façon, la décompression des brins d'ADN originaux et la synthèse de brins d'ADN frais vont de pair.

ADN polymérase :

L'ADN polymérase est l'enzyme principale de la réplication de l'ADN. Son activité a été démontrée pour la première fois par Kornberg en 1956. Il catalyse l'addition covalente de désoxyribonucléotides au 3 & 8242-OH d'un nucléotide préexistant appelé amorce.

L'enzyme ADN polymérase-1 est maintenant considérée comme une enzyme de réparation de l'ADN plutôt qu'une enzyme de réplication. Cette enzyme est connue pour avoir cinq sites actifs, à savoir le site matrice, le site amorce, le site de clivage 5’->3′ ou exonucléase, le site nucléoside triphosphate et le site de clivage 3’->5′ (ou 3’->5&# 8242 site exonucléase).

ADN polymérase I :

Il est principalement impliqué dans l'élimination des amorces d'ARN d'Okazaki ou de fragments précurseurs et dans le comblement des lacunes résultantes en raison de sa capacité de polymérisation 5’->3′. L'enzyme ADN polymérase I peut également éliminer les dimères de thymine produits en raison de l'irradiation UV et combler le vide dû à l'excision. C'est ce qu'on appelle la fonction de relecture ou d'édition de cette enzyme.

ADN polymérase II :

Cette enzyme ressemble à l'ADN polymérase-I dans son activité, mais est une enzyme de réparation de l'ADN et provoque la croissance dans la direction 5’-> 3′, en utilisant des groupes 3′-OH libres.

ADN polymérase III :

Il joue un rôle essentiel dans la réplication de l'ADN. C'est une enzyme multimère ou holoenzyme ayant dix sous-unités telles que α, , ε, , , y, , ’, x et Ψ. Toutes ces dix sous-unités sont nécessaires à la réplication de l'ADN in vitro, toutes ayant des fonctions différentes. Par exemple, la sous-unité α a une activité de relecture ou d'édition d'exonucléase 3’—>5′. L'enzyme centrale comprend trois sous-unités - , et . Les sept sous-unités restantes augmentent la processivité (la processivité signifie la rapidité et l'efficacité avec lesquelles une ADN polymérase étend la chaîne de croissance).

ADN polymérase eucaryote :

Les yotes d'Eukai (par exemple, levure, foie de rat, cellules tumorales humaines) contiennent les cinq types d'ADN polymérases suivants :

(i) ADN polymérase :

Cette enzyme de poids moléculaire relativement élevé est également appelée polymérase cytoplasmique ou grande polymérase. On le trouve à la fois dans le noyau et le cytoplasme.

Cette enzyme est également appelée polymérase nucléaire ou petite polymérase et ne se trouve que chez les vertébrés.

Cette enzyme est appelée polymérase mitochondriale et est codée dans le noyau.

Cette enzyme se trouve dans les cellules de mammifères et est dépendante du PCNA pour la processivité de la synthèse de l'ADN (PCNA = antigène nucléaire de la cellule proliférante).

Il était auparavant connu sous le nom d'ADN polymérase 5II. Cette enzyme est indépendante du PCNA et est présente dans les cellules HeLa de mammifères et la levure en herbe.

La grande ADN polymérase a est l'enzyme ADN polymérase prédominante des cellules eucaryotes et a longtemps été considérée comme la seule enzyme impliquée dans la réplication de l'ADN. Mais maintenant, une autre polymérase, à savoir l'ADN polymérase 8, est également impliquée dans la réplication de l'ADN eucaryote.

Amorces d'ADN :

Ces enzymes catalysent la synthèse d'amorces d'ARN qui sont une condition préalable à l'initiation de la réplication de l'ADN dans la grande majorité des organismes. Avant le début de la réplication réelle de l'ADN, de courts segments d'oligonucléotides d'ARN, appelés amorces d'ARN ou simplement amorces, doivent être synthétisés par l'enzyme ADN primase à l'aide de ribonucléoside triphosphates.

Cette amorce d'ARN est synthétisée en copiant une séquence de bases particulière à partir d'un brin d'ADN et diffère d'une molécule d'ARN typique en ce qu'après la synthèse, l'amorce reste liée hydrogène à la matrice d'ADN.

Les amorces ont une longueur d'environ 10 nucléotides chez les eucaryotes et elles sont fabriquées à intervalles sur le brin retardé où elles sont allongées par l'enzyme ADN polymérase pour commencer chaque fragment d'okazaki. Ces amorces d'ARN sont ensuite excisées et remplies d'ADN à l'aide du système de réparation de l'ADN chez les eucaryotes.

Chez les bactéries, deux enzymes différentes sont connues pour synthétiser des oligonucléotides d'ARN amorces : l'ARN polymérase (sur le brin principal) et l'ADN primase (sur le brin retardé).

Polynucléotide ligase :

Cette enzyme est une enzyme importante à la fois dans la réplication de l'ADN et dans la réparation de l'ADN. L'ADN ligase catalyse la formation d'une liaison phosphodiester entre le groupe 5 & 8242-phosphoryle d'un nucléotide et le groupe 3-OH du voisin immédiat sur le côté d'une entaille dans un brin d'ADN, ainsi elle scelle les entailles dans un brin d'ADN.

Les endonucléases, en particulier les endonucléases de restriction, sont également importantes pendant la réplication de l'ADN ainsi que la réparation de l'ADN. Au cours de la réplication de l'ADN, une endouncléase peut produire une entaille dans l'origine pour initier la réplication ou elle peut induire des entailles pour générer un pivot pour faciliter le déroulement de l'ADN.

Enzymes impliquées dans l'ouverture de l'hélice d'ADN :

Les ADN hélicases sont des enzymes de déroulement dépendantes de l'ATP qui favorisent la séparation des deux brins parentaux et établissent des fourches de réplication qui s'éloigneront progressivement de l'origine. Le déroulement de l'hélice d'ADN matrice au niveau d'une fourche de réplication pourrait en principe être catalysé par deux hélicases d'ADN, agissant de concert, l'une le long du brin principal et l'autre le long du brin retardé.

Brin déstabilisant l'hélice (également appelé protéines de liaison à l'ADN simple brin ou SSBP) :

Derrière la fourche de réplication, les brins d'ADN simples sont empêchés de s'enrouler les uns sur les autres (ou de former des boucles en épingle à cheveux double brin dans chaque brin simple) par l'action des protéines SSB. Les protéines SSB se lient aux brins d'ADN exposés sans recouvrir les bases, qui restent donc disponibles pour le processus de modélisation.

Topoisomérases (ADN gyrases) :

L'action d'une hélicase introduit une superbobine positive dans l'ADN duplex avant la fourche de réplication. Les enzymes, appelées topoisomérases, détendent la superbobine en se fixant au duplex de superbobine de manière transitoire, en coupant l'un des brins et en le faisant tourner à travers le brin ininterrompu. L'entaille est ensuite refermée.

Un type de topoisomérase (c'est-à-dire la topoisomérase I) provoque une rupture ou une coupure simple brin qui permet aux deux sections de l'hélice d'ADN de chaque côté de l'entaille de tourner librement l'une par rapport à l'autre, en utilisant la liaison phosphodiester dans le brin opposé à l'entaille comme un point de pivot. Un deuxième type de topoisomérase (c.

Un réplicon est l'unité d'ADN dans laquelle des actes individuels de réplication ont lieu, c'est-à-dire qu'il est capable de réplication d'ADN indépendamment des autres segments d'ADN. Par conséquent, chaque réplicon a une origine dans laquelle la réplication est initiée et il peut avoir une terminaison à laquelle la réplication s'arrête.

Les chromosomes bactériens et viraux contiennent généralement un seul réplicon/chromosome. Bien que le phage T ait deux origines, une primaire et une secondaire, mais en présence d'origine primaire, l'origine secondaire est, en règle générale, non fonctionnelle. Chez E. coli, le point d'origine est identifié comme le locus génétique oriC.

Une origine procaryote complète prend en charge les trois fonctions suivantes : (1) l'initiation de la réplication, (2) le contrôle de la fréquence des événements d'initiation et (3) la ségrégation des chromosomes répliqués dans les cellules filles.

Des origines ont été identifiées dans les bactéries, les levures, les chloroplastes et les mitochondries, leur caractéristique générale importante est qu'ils sont riches en A : T, ce qui peut être important pour faciliter le déroulement lors de la réplication. L'origine bactérienne contient de nombreux sites courts différents ( < 10 pb) qui sont nécessaires à sa fonction. Ces sites sont parfois séparés par des distances spécifiques mais pas par des séquences spécifiques. Ces sites spécifiquement localisés sont nécessaires à la liaison de différentes protéines impliquées dans la réplication de l'ADN.

Plusieurs réplicons procaryotes ont des sites spécifiques, appelés terminus, qui arrêtent le mouvement de la fourche de réplication et, ainsi, terminent la réplication de l'ADN. Le chromosome d'E. coli a deux extrémités, appelées T1 et T2 situé à environ 100 Ko de chaque côté du point où les fourches de réplication se rencontreraient. Chaque terminus est spécifique à une direction de mouvement de la fourche.

Le T1 et T2 sont disposés de telle sorte que chaque fourche doive se croiser pour atteindre le terminus qui lui est propre. La terminaison de la réplication nécessite le produit du gène tus, qui code probablement pour une protéine qui reconnaît T, et T2.

Chez les eucaryotes, chaque chromosome a plusieurs réplicons (par exemple, levure, 500 drosophiles, 3 500 souris 25 000 Viciafaba, 35 000). À un moment donné de la phase S, seuls certains de ces réplicons subissent une réplication, chaque réplicon semble être activé à un moment précis dans une séquence spécifique. La longueur d'un réplicon eucaryote peut varier de 40 Kb chez la levure et la drosophile à environ 300 Kb chez Vicia.

Le nombre de réplicons détectables semble varier avec le stade de développement et le type de cellule ou de tissu. Ceci est expliqué sur la base d'origines spécifiques aux tissus, de sorte que certaines origines sont actives dans certains tissus, tandis que d'autres sont actives dans d'autres tissus.

Ceci est illustré par la drosophile où les premières cellules embryonnaires ont 10 fois plus de réplicons que celles des cellules somatiques adultes. Les preuves disponibles suggèrent que les réplicons eucaryotes n'ont pas de terminaisons.

Fidélité de réplication :

Le taux d'erreur de réplication de l'ADN est bien inférieur à celui de la transcription en raison de la nécessité de préserver le sens du message génétique d'une génération à l'autre. Par exemple, le taux de mutation spontanée dans E. coli est d'environ une erreur pour 10 10 bases incorporées lors de la réplication.

Ceci est dû principalement à la présence des formes tautomères mineures des bases qui ont des propriétés d'appariement des bases altérées. Le taux d'erreur est minimisé par une variété de mécanismes. Les ADN polymérases n'incorporeront un nucléotide entrant que s'il forme la paire de bases correcte avec le nucléotide matrice dans son site actif.

L'erreur occasionnelle est détectée par l'exonucléase de relecture 3’—>5′ associée à la polymérase. Cela supprime le nucléotide incorrect de l'extrémité 3 & 8242 avant toute autre incorporation, permettant ensuite à la polymérase d'insérer la base correcte. Pour que l'exonucléase de relecture fonctionne correctement, elle doit être capable de distinguer une paire de bases correcte d'une paire incorrecte.

La mobilité accrue des paires de bases "non ancrées" à l'extrémité 5 des fragments d'ADN en retard nouvellement initiés signifie qu'elles ne peuvent jamais sembler correctes et ne peuvent donc pas être relues. Par conséquent, les premiers nucléotides sont des ribonucléotides (ARN), de sorte qu'ils peuvent ensuite être identifiés comme du matériel de faible fidélité et remplacés par de l'ADN allongé (et relu) du fragment adjacent. Les erreurs qui échappent à la relecture sont corrigées par un mécanisme de réparation des discordances.

Mécanisme de réplication de l'ADN chez les procaryotes :

La réplication de l'ADN in vitro a été largement étudiée dans E. coli et dans les phages et plasmides d'E. coli. Chez E. coli, le processus de réplication de l'ADN comprend les trois étapes principales suivantes :

1. Initiation de la réplication de l'ADN :

Ce processus comprend trois étapes : (i) la reconnaissance de l'origine (O), (ii) l'ouverture du duplex d'ADN pour générer une région d'ADN simple brin, et (iii) la capture de la protéine d'ADN B (c'est-à-dire 5′ 3&# 8242 hélicase agit également comme activateur de la primase). Ainsi, le complexe ATP d'ADN-A (ou protéine initiatrice) se lie à 9 pb aux régions répétées inversées (R,, R,, Rv R4) de ori C de E. coli et favorise l'ouverture du duplex d'ADN dans une région de trois répétitions directes de séquence de 13 pb (appelées 13-mers).

L'ouverture se produit de la droite 13-mer vers la gauche et nécessite un ADN surenroulé négativement et des protéines initiatrices HU ou IHF. L'ADN B (-hélicase) est transféré à l'ADN simple brin exposé et provoque le déroulement de l'ADN en présence d'A TP, de protéine SSB et d'ADN gyrase (une topoisomérase).

Cela entraîne le déroulement du duplex d'ADN et la réplication de l'ori C se déroule dans les deux sens (bidirectionnel). La liaison SSB se produit sur les régions simple brin et deux complexes d'ADN B (= primosomes) sont chargés un sur chaque brin.

2. Allongement de la chaîne d'ADN :

Cette étape nécessite la présence des enzymes et facteurs suivants : 1. ADN B ou hélicase (également appelé promoteur mobile) 2. primase (ADN G) 3. ADN polymérase holoenzyme (ou ADN pol III HE) 4. protéine SSB 5. ARNase H qui élimine les amorces d'ARN 6. ADN polymérase I qui est utilisée pour combler le vide créé en raison des amorces d'ARN et 7. ADN ligase (qui convertit les fragments d'okazaki sans amorce en brin continu). Au cours de la transition de l'initiation à l'allongement, les événements suivants se produisent :

(i) Au fur et à mesure que l'hélicase (ou l'ADN B) se déplace dans la direction 5′ -> 3′, elle génère une fourche de réplication en ouvrant le duplex d'ADN.

(ii) Le brin d'ADN ayant l'hélicase devient le brin retardé. L'ADN primase s'associe à l'hélicase Dna B, formant le primosome qui synthétise plusieurs amorces pour le brin retardé et une seule amorce d'ARN pour le brin principal.

(iii) Pour la synthèse du brin retardé, l'ADN pol III HE doit travailler sur le même brin auquel l'hélicase Dna B est liée, mais il se déplace en sens inverse.

(iii) l'hélicase DnaB, l'ADN Gprimase et l'ADN pol III FIE travaillent ensemble dans l'élongation des brins. L'assemblage de l'hélicase et de l'ADN polymérase reste processif, c'est-à-dire qu'ils restent étroitement liés à la fourche et restent liés tout au long de la réaction.

La synthèse (- allongement) des brins en retard et en avance a lieu par des méthodes quelque peu différentes, c'est beaucoup plus complexe pour le brin en retard que pour le brin d'avance :

(UNE) Synthèse discontinue sur brin retardé :

1. La primase est extraite de la solution et activée par l'hélicase (DnaB) pour synthétiser une amorce d'ARNa (10 à 20 nt ou nucléotides de long) sur le brin retardé.

2. Les amorces d'ARN sont reconnues par l'ADN pol III HE sur le brin retardé et sont utilisées pour la synthèse de fragments précurseurs ou okazaki. En effet, chaque nouvelle amorce d'ARN est reconnue par la sous-unité gamma (y) de l'ADN pol III HE et chargée en sous-unité p de la même polymérase. Cette sous-unité p préchargée peut alors capturer le noyau d'ADN poly III HE lorsqu'il devient disponible après avoir terminé son travail de synthèse sur le fragment d'okazaki précédent.

3. Une fois les fragments d'okazaki terminés, les amorces d'ARN sont excisées par l'ADN polymérase 1, qui comble ensuite les lacunes résultantes avec de l'ADN.

4. Une fois que l'ADN polymérase I a ajouté les désoxyribonucléotides finaux dans l'espace laissé par l'amorce excisée, l'enzyme ADN ligase forme la liaison phosphodiester qui relie l'extrémité 3 & 8242 libre du remplacement de l'amorce à l'extrémité 5 & 8242 du fragment d'okazaki.

(B) Synthèse continue sur le brin principal :

1. Dans la réplication bidirectionnelle de l'ADN, le brin principal est amorcé une fois sur chacun des brins parentaux.

2. L'amorce d'ARN du brin principal est synthétisée par l'enzyme ARN polymérase.

3. L'ADN pol III HE provoque l'allongement du brin principal et enfin les enzymes ADN pol 1 et ligase donnent la touche finale au brin principal comme dans le cas du brin retardé.

Réplication de l'ADN chez les eucaryotes:

La réplication de l'ADN eucaryote nécessite deux enzymes ADN polymérases différentes, à savoir l'ADN polymérase a et l'ADN polymérase . L'ADN polymérase synthétise l'ADN sur le brin principal (synthèse d'ADN continue), tandis que l'ADN polymérase a synthétise l'ADN sur le brin retardé (synthèse d'ADN discontinue). Outre ces deux enzymes, la réplication de l'ADN : (1) antigène T (2) facteur de réplication A ou RF-A (également appelé RP-A ou SSB eucaryote) (3) topoisomérase I (4) topoisomérase II (5) proliférant – l'antigène nucléaire cellulaire (PCNA, également appelé cycline) et (6) le facteur de réplication Cor RF-C.

Le processus de réplication de l'ADN eucaryote comprend les étapes suivantes :

1. Avant le début de la synthèse d'ADN, il y a une étape présynthétique d'une durée de 8 à 10 minutes pour la formation d'un complexe d'ADN déroulé. Cette étape ne nécessite que trois protéines purifiées, à savoir l'antigène T (T-ag ou antigène tumoral), RF-A et les topiosomérases I et II.

2. L'antigène T, en utilisant son domaine de liaison à l'ADN, forme un complexe multi-sous-unités avec le site I et le site II en présence d'A TP et provoque un déroulement local.

3. Un déroulement duplex plus étendu se produit en raison de l'association de RF-A et d'une topoisomérase avec l'aide du composant ADN hélicase de T-ago. Les topoisomérases aident au déroulement de l'ADN en modifiant la topologie de l'ADN au niveau de la fourche de réplication.

4. Les protéines RF-A ou SSB se lient à l'ADN simple brin déroulé.

5. La synthèse d'ARN d'amorce est réalisée par la primase qui est étroitement associée à l'ADN polymérase ex.

6. L'ADN polymérase a aide à la synthèse d'un fragment d'okazaki dans les directions 5 & 8242 à 3 & 8242.

7. Le facteur de réplication C (ou RF-C) et le PCNA (cycline) aident à la commutation des ADN polymérases de sorte que pol a soit remplacé par pol 5 qui a ensuite synthétisé en continu l'ADN sur le brin principal.

8. Un autre fragment d'okazaki est ensuite synthétisé à partir de la fourche de réplication sur le brin retardé par le complexe pol a – primase et cette étape est répétée encore et encore, jusqu'à ce que toute la molécule d'ADN soit recouverte.

9. Les amorces d'ARN sont retirées et les lacunes sont comblées comme dans la réplication d'ADN procaryote.

Récemment, le rôle de l'ADN polymérase e dans la réplication de l'ADN a été souligné, de sorte que trois ADN polymérases (a, et ) sont maintenant connues pour être impliquées dans la réplication de l'ADN eucaryote. A. Sugino et ses collègues ont proposé que l'ADN polymérase a puisse fonctionner à la fois sur les brins avant et arrière (puisque la polymérase a a une activité primase ), tandis que la polymérase e et la polymérase 5 sont impliquées dans l'allongement des brins avant et arrière respectivement.

Dommages à l'ADN et mécanisme de réparation

1. Lésions de l'ADN :

Une altération de la structure chimique ou physique normale de l'ADN est ce qu'on appelle des lésions de l'ADN. De nombreux agents exogènes, tels que les produits chimiques et les rayonnements, peuvent modifier la position des atomes d'azote et de carbone dans les systèmes de noyaux hétérocycliques des bases et certains des groupes fonctionnels exocycliques (c'est-à-dire les groupes céto et amino des bases).

Cela peut entraîner une perte d'appariement de bases ou un appariement de bases altéré (par exemple, un A altéré peut s'apparier avec C au lieu de T). Si une telle lésion est autorisée à rester dans l'ADN, une mutation peut se fixer dans l'ADN par mutagenèse directe ou indirecte.

Alternativement, le changement chimique peut produire une distorsion physique dans l'ADN qui bloque la réplication et/ou la transcription, provoquant la mort cellulaire. Ainsi, les lésions de l'ADN peuvent être mutagènes et/ou létales. Certaines lésions sont spontanées et timides et surviennent en raison de la réactivité chimique inhérente de l'ADN et de la présence d'espèces chimiques réactives normales dans la cellule.

Par exemple, la cytosine de base subit une désamination hydrolytique spontanée pour donner l'uracile. S'il n'est pas réparé, l'uracile résultant formerait une paire de bases avec l'adénine lors de la réplication ultérieure, donnant lieu à une mutation ponctuelle. La dépurination est une autre réaction hydrolytique spontanée qui implique le clivage de la liaison N-glycosylique entre N-9 des bases puriques A et G et C-l’ du sucre désoxyribose et donc la perte de bases puriques de l'ADN. Le squelette sucre-phosphate de l'ADN reste intact. Le site apurinique résultant est une lésion non codante, car les informations codées dans les bases puriques sont perdues.

2. Dommages oxydatifs :

Cela se produit dans des conditions normales en raison de la présence d'espèces réactives d'oxygène (ROS) dans toutes les cellules aérobies, par exemple le superoxyde, le peroxyde d'hydrogène et, surtout, le radical hydroxyle (OH). Ce radical peut attaquer l'ADN, I à un certain nombre de points, produisant une gamme de produits d'oxydation avec des propriétés II modifiées, par exemple la 8-oxoguanine, la 2-oxoadénine et le 5-formyluracile. Les niveaux de ceux-ci peuvent être augmentés par les radicaux hydroxyles de la radiolyse de l'eau provoquée par les rayonnements ionisants.

3. Alkylation :

Les agents alkylants sont des produits chimiques électrophiles qui ajoutent facilement des groupes alkyle (par exemple, méthyle) à diverses positions sur les acides nucléiques distinctes de ceux méthylés par les enzymes de méthylation normales. Des exemples courants sont le méthylméthane sulfonate (MMS) et l'éthylnitrosourée (ENU).

Des exemples typiques de bases méthylées sont la 7-méthylguanine, la 3-méthyl-adénine, la 3-méthylguanine et la 06-méthylguanine. Certaines de ces lésions sont potentiellement mortelles car elles peuvent interférer avec le déroulement de l'ADN pendant la réplication et la transcription. La plupart sont également indirectement mutagènes, cependant, la 0 6 -méthylguanine est une lésion directement mutagène car elle peut s'apparier avec la thymine pendant la réplication.

4. Adduits volumineux :

Les dimères de cyclobutane pyrimidine sont formés par la lumière ultraviolette des pyrimidines adjacentes sur un brin par cyclisation des atomes de carbone C5 et C6 à double liaison de chaque base pour donner un cycle cyclobutane. La perte résultante de l'appariement des bases avec le brin opposé provoque une dénaturation localisée de l'ADN produisant une lésion volumineuse qui perturberait la réplication et la transcription. Un autre type de dimère de pyrimidine, le photoproduit 6,4, résulte de la formation d'une liaison entre C6 d'une base pyrimidique et C4 de la base adjacente.

Lorsque le benzo[a]pyrène cancérigène du goudron de houille est métabolisé par le cytochrome P-450 dans le foie, l'un de ses métabolites (un époxyde diol) peut se fixer de manière covalente au groupe 2-amino des résidus guanine. De nombreux autres agents d'arylation aromatiques forment des adduits covalents avec l'ADN. L'aflatoxine B, cancérigène pour le foie, se lie également de manière covalente à l'ADN.

Réparation de l'ADN :

Les systèmes de réparation reconnaissent une variété de changements dans l'ADN pour initier une action. Une cellule peut avoir plusieurs systèmes pour traiter les dommages à l'ADN. Ces systèmes comprennent les éléments suivants : (1) Réparation directe, (2) Réparation par excision (3) Réparation de mésappariement, (4) Systèmes tolérants et (5) Systèmes de récupération.

1. Réparation directe :

L'inversion ou l'élimination simple des dommages à l'ADN est connue sous le nom de réparation directe, par exemple l'élimination des liaisons covalentes entre les deux 4 et deux 5 carbones des deux résidus de thymine participant à la formation de dimères de thymine.

Les dimères de thymine sont généralement formés en raison de l'irradiation UV et interfèrent avec la réplication et la transcription. Kelner (1949) a observé qu'un grand nombre de bactéries pouvaient survivre à de fortes doses de rayonnement UV si elles étaient exposées à une source insensible de lumière visible.

Ce phénomène est appelé photoréactivation.Il a été montré plus tard que pendant l'irradiation UV, une enzyme particulière est sélectivement liée à l'ADN bactérien. Au cours du processus de photoréactivation, l'enzyme est activée par la lumière visible. Il clive les dimères de thymine, leur restituant ainsi leur forme d'origine. Ce processus de réparation est à médiation enzymatique et dépendant de la lumière.

2. Réparation par excision :

Dans ce mécanisme de réparation, le segment endommagé ou altéré du brin d'ADN est excisé et un nouveau patch d'ADN est synthétisé à sa place. Bien que les systèmes de réparation par excision varient dans leur spécificité, la voie principale comprend les trois étapes suivantes :

(i) Reconnaissance et incision :

La section endommagée / altérée d'un brin d'ADN est reconnue par une endonucléase, cette enzyme coupe ensuite le brin affecté des deux côtés de la lésion.

Une exonucléase 5′ –> 3′ (ADN polymérase I) digère la section endommagée/modifiée, ce qui génère une région simple brin dans la double hélice de l'ADN.

Dans cette étape, la région simple brin produite par excision sert de matrice pour une ADN polymérase qui synthétise le remplacement du segment excisé. L'ADN ligase scelle ensuite l'entaille qui reste après la synthèse du remplacement de la section excisée.

Dans E. coli, l'excision est très probablement due à l'activité exonucléase 3′–> 5′ de l'ADN polymérase I, tandis que la synthèse est réalisée par l'activité polymérase 5′–> 3′ de la même enzyme. Les systèmes de réparation par excision sont assez courants chez les procaryotes et les eucaryotes. Certains de ces systèmes reconnaissent des dommages généraux à l'ADN, tandis que d'autres sont très spécifiques, par exemple, les endonucléases AP éliminent les résidus de ribose des sites de dépurination. La réparation par excision implique différentes longueurs d'ADN et est regroupée dans les trois classes suivantes :

(a) Réparation par patch très court (VSP) :

Ce système traite de la réparation des discordances entre des bases spécifiques.

Dans ce système, un brin d'ADN d'environ 20 bases de long est excisé et les dommages sont réparés grâce aux gènes uvr (uvr, A, B, C, de E. coli), codant pour les composants d'une endonucléase de réparation. Une autre enzyme uvr D est également nécessaire pour l'activité hélicase.

Ce système implique l'excision de segments longs d'environ 1500 bases, mais parfois le segment excisé peut être supérieur à 9000 bases. Elle est beaucoup moins fréquente et doit être induite par des dommages qui bloquent la réplication. Chez E. coli, ce système implique également les gènes uvr et l'ADN polymérase I.

3. Réparation d'incompatibilité :

Il s'agit de corriger des mésappariements ou des appariements entre des bases qui ne sont pas complémentaires. Des mésappariements peuvent survenir (a) pendant la réplication ou (b) en raison d'altérations de la base (par exemple, la désamination de la cytosine en uracile) et entraînent des distorsions structurelles dans la double hélice de l'ADN. Ces alternances sont gérées chez E. coli par le système de réparation par excision très courte qui est décrit ci-dessous.

Système de réparation des mésappariements dans E. coli :

Lorsqu'il y a un mésappariement dans une paire de bases comme dans GC -> GT, alors théoriquement, il peut se réparer pour donner naissance soit à un type sauvage (GC) soit à un type mutant (AT). Par conséquent, le système de réparation doit faire la distinction entre les anciens et les nouveaux brins et réparer uniquement le nouveau brin pour restaurer le type sauvage.

Cela se fait par un système de réparation par excision très court et nécessite quatre protéines à savoir Mut L, Mut S, Mut U et Mut H codées dans E. coli respectivement par les gènes mut L, mut S, mut U et mut H. Les erreurs de mésappariement produits lors de la réplication sont corrigés par le système de réparation des barrages.

Le gène dam d'E. coli produit une méthylase qui méthyle l'adénine de séquence GATC sur les deux brins d'ADN. La réplication d'une séquence GATC entièrement méthylée donne une séquence hémiméthylée dans laquelle les résidus A dans les brins nouvellement synthétisés ne sont pas méthylés.

L'état non méthylé de cette séquence cible est utilisé pour identifier le nouveau brin, les bases autour du site de mésappariement dans le nouveau brin sont excisées et un remplacement est synthétisé. Le système implique les produits des gènes mut L, mut S, mut H et uvr D.

Réparations des systèmes de récupération :

Ces systèmes sont également appelés ‘réparation post-réplication’ ou ‘réparation par recombinaison’. Chez E.coli, ce système de réparation est basé sur le gène rec A qui produit la protéine Rec A. La protéine Rec A fonctionne dans l'échange de brins entre les molécules d'ADN pendant la recombinaison génétique et fonctionne également dans l'échange simple brin pendant la réparation par recombinaison. Il semble y avoir deux voies rec A, l'une impliquant les gènes rec B, C et l'autre impliquant rec F.

Ce système de réparation fonctionne lorsqu'une distorsion structurelle bloque la réplication sur le site endommagé. Par exemple, les mutants d'E. coli déficients en réparation par excision seront incapables d'éliminer les dimères de thymine. Dans une telle situation, la réplication se déroule normalement jusqu'aux sites endommagés, l'ADN polymérase arrête la réplication du brin affecté et relance la réplication en sautant au-delà du site endommagé.

Le brin complémentaire est répliqué normalement sur le site endommagé dans l'autre brin. Par conséquent, la réplication donne une descendance normale de molécule d'ADN et une molécule ayant le dimère de thymine dans un brin et un long intervalle dans son brin complémentaire. La molécule d'ADN de la descendance avec le dimère de thymine serait perdue à moins qu'elle ne soit réparée en comblant l'espace dans l'un de ses brins.

Ceci est réalisé au moyen d'un échange simple brin entre les deux molécules d'ADN de la descendance, la région d'échange comble le vide et est induite par la protéine Rec A. À la suite de cet échange, la molécule de descendance normale a une région simple brin qui a un espace. Cette lacune est réparée par la synthèse d'ADN.

Ces systèmes traitent les dommages qui bloquent la réplication normale sur le site endommagé éventuellement en permettant la réplication des sites endommagés avec une fréquence élevée d'erreurs. Ces systèmes peuvent être particulièrement importants chez les eucaryotes où la taille du génome est très grande et donc une réparation complète des dommages est plutôt improbable.


Biologie structurale de la réparation de l'ADN : organisation spatiale des complexes multicomposants de la jonction d'extrémités non homologues

La jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) joue un rôle majeur dans la réparation de l'ADN des cassures double brin, qui implique une série d'étapes médiées par des complexes multiprotéiques. Un hétérodimère Ku70/Ku80 en forme d'anneau se forme d'abord aux extrémités brisées de l'ADN, la sous-unité catalytique de la protéine kinase dépendante de l'ADN (ADN-PKcs) se lie à la synapse et les nucléases traitent les surplombs de l'ADN. L'ADN ligase IV (LigIV) est recrutée sous forme de complexe avec XRCC4 pour la ligature, avec XLF/Cernunnos, jouant un rôle dans l'amélioration de l'activité de LigIV. Nous décrivons comment une combinaison de méthodes - cristallographie aux rayons X, microscopie électronique et diffusion des rayons X aux petits angles - peut donner un aperçu des complexes multicomposants transitoires qui interviennent dans la NHEJ. Nous considérons d'abord l'organisation du complexe ADN-PKcs/Ku70/Ku80/ADN (ADN-PK), puis discutons des preuves émergentes concernant LigIV/XRCC4/XLF/ADN et les complexes d'ordre supérieur. Nous concluons en discutant des rôles des systèmes multiprotéiques dans le maintien d'un rapport signal/bruit élevé et de la valeur des études structurelles dans le développement de nouvelles thérapies en oncologie et ailleurs.

1. Introduction

L'assemblage d'extrémités non homologues (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR) constituent les deux principaux modes de réparation des cassures double brin (DSB) de l'ADN dans les cellules humaines. Bien que HR soit dominante dans les phases S/G2 tardives lorsqu'une chromatide sœur est disponible [1], NHEJ, qui ne nécessite pas de matrice [2], joue un rôle majeur dans la phase G1/S précoce [1]. Il est prédit que chez l'homme, environ 50 DSB endogènes par cellule peuvent se produire au cours de chaque cycle cellulaire [3]. Ceux-ci sont principalement générés par les rayonnements ionisants, les espèces réactives de l'oxygène et la réplication de l'ADN à travers une entaille [2]. Les DSB non réparés peuvent provoquer une perte catastrophique de gènes au cours de la division cellulaire, entraînant des translocations chromosomiques, des taux de mutation accrus et une carcinogenèse [4]. Le système NHEJ est également responsable des DSB programmés dans la recombinaison V(D)J [5] et la recombinaison par commutation de classe [6] au cours du développement de la diversité immunitaire. NHEJ a une voie alternative de jonction d'extrémité, qui est principalement une jonction d'extrémité médiée par la microhomologie [7] et indépendante des composants NHEJ [8]. Ici, NHEJ implique la voie principale NHEJ.

La voie NHEJ comprend trois étapes principales : la synapsis, le traitement final et la ligature [9]. La synapsis est réalisée par une protéine kinase dépendante de l'ADN (ADN-PK) constituée de Ku70, Ku80, d'une sous-unité catalytique d'ADN-PK (ADN-PKcs) et d'ADN. Ku70 et Ku80 forment un hétérodimère en forme d'anneau autour des extrémités cassées de l'ADN et les maintiennent à proximité [10, 11]. L'ADN-PKcs, une très grande protéine appartenant à la famille des kinases apparentées à la phosphatidylinositol-3-OH kinase (PI3K) (PIKKs) [12], est recrutée par interaction avec l'extrémité C-terminale de Ku80 [13, 14], et provoque l'hétérodimère Ku70/80 de se déplacer d'environ un tour hélicoïdal vers l'intérieur à partir de l'extrémité [15] pour faire de la place à l'ADN-PKcs pour se lier à l'ADN. Deux assemblages ADN-PK sont probablement nécessaires pour maintenir les deux extrémités de l'ADN rapprochées [16]. L'ADN-PKcs activé se phosphoryle lui-même et diverses protéines, y compris les autres composants NHEJ [17, 18]. Synapsis induit l'autophosphorylation de l'ADN-PKcs et permet à d'autres protéines NHEJ d'accéder aux extrémités de l'ADN [19, 20].

Le traitement final implique des nucléases telles que Artemis [21], qui est capable de couper un ensemble de surplombs d'ADN et est considérée comme suffisante comme nucléase, bien que d'autres nucléases en particulier PNK, aprataxine (APTX) et PNK-APTX-like facteur (PALF), un

exonucléase, ne peut être exclue [22]. Artemis interagit avec l'ADN-PKcs et ouvre des épingles à cheveux d'ADN dans le processus de recombinaison V(D)J [23]. mutations dans Artémis gène cause Immunodéficience combinée sévère radiosensible (RS-SCID) [21]. Polymérases Pol

utilisent leurs domaines BRCT pour se lier aux complexes Ku/ADN et la désoxynucléotidyl transférase terminale (TdT) est exclusivement exprimée dans les cellules lymphoïdes initiales pour s'engager dans la NHEJ du processus de recombinaison V(D)J [24-26]. En outre, comme récemment montré Ku dans son rôle de lyase participe également au traitement final de l'ADN coupant au niveau des sites abasiques, indiquant que cette protéine, comme son partenaire DNA-PKcs, a des propriétés enzymatiques et remplit ainsi un certain nombre de rôles dans la voie NHEJ [ 27].

L'étape de ligature finale de la jonction est médiée par l'ADN ligase IV (LigIV), qui est associée au groupe de complémentation croisée aux rayons X dimère 4 (XRCC4) [28]. Ces protéines forment un complexe très stable, maintenu à 2 M de NaCl ou 7 M d'urée [29]. XRCC4 stimule l'adénylation et l'activité de la ligase [30–32]. Les knock-outs de ces gènes chez la souris entraînent une létalité embryonnaire tardive de manière dépendante de p53 [33-36] tandis que des mutations dans lig4 gène entraîne un syndrome LIG4 caractérisé par une radiosensibilité, des traits du visage inhabituels, une microcéphalie, un retard de développement et de croissance, une pancytopénie et une anomalie cutanée [37]. XRCC4-Like Factor (XLF)/Cernunnos (XLF), dont les mutations chez l'homme provoquent une immunodéficience combinée sévère, interagit également avec XRCC4 et améliore la ligature par LigIV [38, 39].

Ici, nous passons en revue ce que l'on sait des architectures des complexes multi-composants transitoires qui interviennent dans l'assemblage d'extrémités non homologues. La figure 1 est une tentative de construire un diagramme d'interaction qui résume notre compréhension actuelle des interactions des protéines NHEJ et de la phosphorylation par l'ADN-PKcs, indiquant où les informations structurelles sont disponibles. Bien que l'existence d'ADN-PK - le complexe entre l'ADN-PKcs, le Ku hétérodimère et l'ADN - soit clairement définie, tout comme le complexe étroit entre XRCC4 et LigIV, l'organisation temporelle et spatiale des complexes d'ordre supérieur n'est pas claire. Existe-t-il des sous-complexes qui permettent au Ku de sortir de l'ADN avant la ligature, ou existe-t-il un supercomplexe dans lequel coexistent DNA-PK, LigIV/XRCC4 et XLF pour réaliser la ligature ? Dans ce cas, comment Ku quitte-t-il lorsque les extrémités sont ligaturées ? Dans cet article, nous examinons d'abord ce que l'on sait de la structure de l'énorme chaîne ADN-PKcs et comment cela pourrait conduire à une meilleure compréhension de la cible à utiliser dans la découverte de médicaments guidée par la structure. Nous discutons ensuite de l'organisation du complexe DNA-PKcs/Ku70/Ku80/DNA (appelé DNA-PK), afin de faire la lumière sur les premiers événements qui se déroulent dans la voie NHEJ. Nous discutons des preuves émergentes concernant les structures 3D des complexes LigIV/XRCC4/XLF/ADN, qui devraient donner des indices sur le mécanisme de liaison et fonctionnel de LigIV/XRCC4 et XLF dans le NHEJ. Enfin, nous considérons l'arrangement spatial des complexes d'ordre supérieur afin de donner une image du système de réparation NHEJ dans son ensemble.


Schéma de principe des interactions de la machinerie NHEJ. Les formes colorées indiquent les protéines et les complexes avec des structures 3D connues. Les flèches pleines indiquent des interactions confirmées tandis que les flèches en pointillés sont des interactions plausibles. Les événements de phosphorylation sont indiqués par la lettre « p ».

2. Biologie structurelle des composants individuels

Des progrès considérables ont été réalisés dans la biologie structurelle des composants individuels et des complexes de la machinerie de réparation NHEJ, mais des travaux supplémentaires sont nécessaires pour comprendre l'organisation spatiale de ce processus complexe et dynamique. Ici, nous discutons de ce que l'on sait de chaque composant avant de discuter des complexes multiprotéiques qui interviennent dans leurs fonctions dans NHEJ.

2.1. Ku70/80

L'activité de liaison terminale de l'ADN double brin (ds) de Ku70 et Ku80 nécessite leur association pour former un hétérodimère [40]. La structure cristalline de l'hétérodimère Ku70/Ku80 révèle une topologie et une organisation de domaine similaires, comprenant un amino-terminal

domaine, un domaine central en tonneau et un bras C-terminal hélicoïdal [10]. Ces protéines, lorsqu'elles sont associées, forment une structure pseudo-symétrique, dans laquelle les résidus qui contribuent à l'interface dimère présentent un faible niveau d'identité de séquence (environ 15 % Figure 2), favorisant la formation d'hétérodimères par rapport à l'homodimérisation Ku70-Ku70 ou Ku80-Ku80.


Ku70 et Ku80 ont aligné les séquences sur la base de leurs structures. Ils montrent une organisation de domaine similaire malgré la faible identité de séquence. L'alignement a été créé avec ClustalW2 [41] et visualisé avec ESPript [42]. De nombreux résidus sont conservés (boîte noire) ou semi-conservé/similaire (boîte grise).

La structure cristalline de l'hétérodimère Ku70/80 en complexe avec un fragment d'ADN en forme de Y de 55 nucléotides montre que l'hétérodimère Ku70/80 adopte la forme d'un anneau qui entoure l'ADN duplex (Figure 3). Aucun grand changement de conformation ne se produit lors de la liaison de l'ADN au Ku hétérodimère, à l'exception des domaines C-terminaux de Ku70 et Ku80. En effet, aucun contact avec les bases d'ADN et seulement quelques interactions avec le squelette sucre-phosphate ne sont effectués. Le duplex d'ADN est embrassé à travers l'anneau préformé Ku70/80 de telle manière qu'une face d'ADN est relativement accessible au solvant et donc exposée aux enzymes de traitement qui éliminent les nucléotides endommagés et comblent les lacunes avant la ligature. Ces caractéristiques peuvent fournir un support structurel aux extrémités d'ADN cassées et mettre l'hélice d'ADN en phase à travers la jonction pendant le traitement des extrémités et la ligature. Bien que l'hétérodimère Ku70/80 montre une faible affinité pour l'ADN circularisé [43] et ne se lie à aucun substrat d'ADN plus court que 14 pb, il se lie aux fragments d'ADNdb de longueur et de structure similaires d'une manière indépendante de la séquence d'ADN et indépendamment du fait que l'ADN se termine sont émoussés, avec des boucles en épingle à cheveux, ou


(une)
(b)
(une)
(b) L'hétérodimérisation de Ku70/80 définit une forme d'anneau qui lie l'ADN. Structures cristallines de l'hétérodimère Ku70/80 en l'absence d'ADN (a) et sous forme liée à l'ADN (b). Adapté de [10].
2.2. ADN-PKcs

La structure de l'ADN-PKcs s'est avérée assez insaisissable. De beaux travaux réalisés en utilisant la reconstruction par microscopie cryoélectronique d'ADN-PKcs [44–47] ont donné une bonne impression de la structure globale (voir Figure 4(a)). Ceci est maintenant complété par des travaux dans notre laboratoire. Nous avons montré que les cristaux d'ADN-PKcs peuvent être cultivés et diffractés à une résolution d'environ 8,5 Å, mais la diffraction est meilleure pour les complexes avec des fragments C-terminaux de Ku80, probablement en raison d'une stabilisation de l'ADN-PKcs dans le complexe conduisant à une meilleure commande de l'emballage de cristal. Nous avons récemment utilisé une dispersion anormale multi-longueurs d'onde avec le

cluster de métaux lourds [48] pour résoudre la structure de l'ADN-PKcs en complexe avec le domaine C-terminal de Ku80 à une résolution de 6,6 Å (Figure 4(b)).


(a) Microscopie cryoélectronique
(b) Cristallographie aux rayons X
(a) Microscopie cryoélectronique
(b) Cristallographie aux rayons X Vues équivalentes de l'ADN-PKcs telles que définies par (a) la microscopie cryoélectronique et (b) la cristallographie des protéines aux rayons X. Les références aux publications et résolutions des modèles sont données ci-dessus. Le codage couleur de ces structures EM est tel qu'indiqué dans leurs publications respectives [44–47]. La carte expérimentale de densité électronique cristallographique aux rayons X est telle que définie par Sibanda et al. [48].

Une grande partie de la chaîne polypeptidique ADN-PKcs est construite à partir d'unités répétées HEAT (figure 5) pour former plusieurs domaines séparés. La structure tertiaire de l'ADN-PKcs mesure 160 Â de haut et 120 Â de diamètre, comme le montre la figure 6 (a). À partir de l'extrémité N-terminale, des motifs répétés HEAT comprenant environ 66 hélices se replient en une structure circulaire creuse qui, vue de côté, ressemble à un berceau (figure 6(b)). La chaîne change de direction avant que le cercle ne soit terminé, laissant ainsi un espace (figure 6(a)). Au sein de cette structure circulaire, la régularité des répétitions HEAT se décompose en certains points, comme indiqué sur la figure 6(a) avec des flèches bleues. Ces points d'irrégularité peuvent jouer un rôle dans les changements conformationnels qui ont été impliqués dans la fonction de cette molécule [16]. Il est possible que ces changements de conformation aient une incidence sur la taille de l'espace (figure 6 (a)), qui peut avoir un rôle dans la libération de DNA-PKcs à partir des extrémités de l'ADN lorsque NHEJ est terminé. La structure en anneau agit très probablement comme une plate-forme pour les protéines qui s'engagent dans la réparation de l'ADN brisé et, avec Ku, maintient l'ADN en place pendant qu'il est en cours de réparation.



Structure cristalline de l'ADN-PKcs. Surface moléculaire de la structure DNA-PKcs montrant (a) des vues de face et (b) de côté. La taille globale de l'ADN-PKcs est également indiquée en (a) avec les sites flexibles potentiels indiqués par les flèches bleues. La molécule est codée par couleur comme suit : la structure annulaire qui est principalement composée de répétitions HEAT est verte le front qui fait partie de la structure annulaire est vert clair le domaine putatif de liaison à l'ADN est magenta la partie C-terminale la plus grande qui inclut les domaines FAT et FATC est rouge et le domaine kinase est jaune.

Dans la deuxième partie de la structure, la chaîne polypeptidique exploite les répétitions HEAT pour se replier en un petit domaine globulaire putatif de liaison à l'ADN au sein de la structure circulaire. Il est connu que l'ADN-PKcs lie à la fois l'ADN double brin et simple brin. Williams et al. (2008) ont proposé que "la saillie" dans leur structure cryo-EM lie l'ADN [47], et cette saillie est équivalente au petit domaine globulaire situé dans la région circulaire de la structure cristalline. Cela reste le meilleur candidat pour la reconnaissance de l'ADN simple et double brin, mais des travaux supplémentaires sur les cristaux d'ADN-PK (ADN-PKcs, Ku, complexe d'ADN) à une structure de résolution plus élevée de l'ADN-PKcs seront nécessaires pour le confirmer. Troisièmement, la région C-terminale se replie dans la tête/couronne qui est perchée juste au sommet de la structure circulaire en forme de berceau et s'étend plus loin en arrière. Cette partie contient le FAT, le domaine kinase, le FATC et diverses parties où d'autres protéines, comme indiqué par des études biochimiques, peuvent se lier pour former des complexes avec l'ADN-PKcs (Figure 7).


Diagramme schématique des implications séquence-fonction ADN-PKcs.Quatre régions hautement conservées (HCR) sont présentées [49] Sites putatifs des domaines kinase, FAT et FATC pour les signaux de localisation nucléaire (NLS) [49] Sites d'autophosphorylation PQR [50], ABCDE [19], S3205 [51], S3821, Sites de clivage S4026, T4102 [52] et T3950 [53] pour la protéase apoptotique caspase-3 [49, 54-56] sites de liaison pour la Lyn tyrosine kinase [57], protéine C1D qui interagit au niveau du motif leucine-zipper de l'ADN- PKcs [58], protéine phosphatase-5 (PP5) qui se lie, en utilisant sa répétition tétratricopeptide (TPR), pour déphosphoryler l'ADN-PKcs à S2056 et T2609 [59], Ku70/80 qui se lie pour présenter les extrémités double brin d'ADN endommagées à DNA-PKcs [60], la protéine interagissant avec la kinase (KIP) [61], et c-Abl qui se lie à l'aide de son SH3 une liaison déclenchée par des dommages à l'ADN [60].

Le noyau de la structure kinase de PI(3)K

, l'un des membres de la famille, a été superposé à cette région tête/couronne, ce qui a donné un ajustement plausible aux brins du lobe N et aux hélices du lobe C (Figure 8). À cet endroit, la kinase est exposée et facilement accessible aux substrats (figure 8). À partir de l'emplacement du domaine kinase, les positions des régions FAT et FATC peuvent être déduites (figure 7) car le domaine kinase "se blottit" probablement entre ces deux régions [62].


Domaine ADN-PKcs kinase. La figure montre une caricature de la structure globale de l'ADN-PKcs représentant la position du domaine kinase. Le codage couleur est tel qu'illustré à la figure 6. La modélisation du domaine catalytique DNA-PKcs était basée sur la structure cristalline de l'un des membres de sa famille, le PI(3)K

kinase (code PDB : 1E8X). Un gros plan du domaine catalytique DNA-PKcs est également montré. Les hélices d'ADN-PKcs marquées (a) et (b) pourraient être occupées par des hélices du lobe N de PI(3)K

La taille du monomère de DNA-PKcs est prédite par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) à environ 155 [63], largement en accord avec celle de la structure cristallographique. L'ADN-PKcs se dimérise sans ADN d'une manière dépendante de la concentration. Les données SAXS indiquent un grand changement de conformation entre l'ADN-PKcs autophosphorylée et non phosphorylée. De plus, la reconstruction de la forme de l'ADN-PKcs phosphorylée montre une fente plus large entre les domaines de la tête et de la paume que dans l'enzyme non phosphorylée.

2.3. ADN ligase IV

La LigIV humaine s'est également avérée difficile à étudier isolément en raison de son instabilité et de sa flexibilité, mais elle est stabilisée par interaction avec XRCC4 [28]. Chez l'homme, LigIV est l'une des trois ADN ligases dépendantes de l'ATP, I, III et IV, et joue un rôle central dans la NHEJ eucaryote. LigIV peut être divisé en régions catalytique et d'interaction. Il existe d'excellentes revues de la comparaison des structures des ADN et ARN ligases, et des enzymes de coiffage de l'ARN ailleurs [64-67].

LigIV appartient à la superfamille des nucléotidyltransférases et réalise une réaction de transfert de nucléotidyle en trois étapes : la formation d'un intermédiaire covalent enzyme-nucléotide monophosphate (NMP) (étape 1), la transformation de la NMP en un -phosphate de polynucléotide (étape 2), et la jonction du -phosphate avec -hydroxyle pour sceller deux polynucléotides (étape 3) [68]. Ces enzymes ont quatre motifs communs (I, III, IV, V) et en plus deux autres motifs (III et VI), qui sont conservés parmi les enzymes de coiffage cellulaire et virale de la PPA et les ADN ligases eucaryotes dépendantes de l'ATP [69]. Un motif récemment découvert, Va, est bien conservé parmi les ADN ligases humaines [70]. Le motif I KX(D/N)G possède la lysine catalytique qui forme l'intermédiaire covalent NMP. Les motifs I-V sont localisés dans le domaine nucléotidyltransférase (NTase) (Figure 9), dont le noyau comprend trois feuillets principalement antiparallèles flanqués de six -hélices [64]. Les motifs Va et VI appartiennent au domaine de liaison oligonucléotide/oligosaccharide (OBD) (Figure 9), qui a le tonneau à clé grecque à cinq brins coiffé d'une hélice [64, 71]. La NTase et l'OBD sont conservées parmi les enzymes de coiffage et les ADN ligases [64]. La plupart des mutations du syndrome LigIV sont retrouvées dans la NTase et l'OBD [72] (Figure 9).


Schéma de principe de l'ADN ligase humaine IV. Les limites de domaine montrées sur la figure sont basées sur la structure cristallographique de l'ADN ligase I humaine [73] et des domaines BRCT de LigIV [94]. Les motifs conservés (I, III, IIIa, IV, V, Va et VI) sont représentés dans des rectangles oranges [69, 70]. La lysine catalytique conservée est indiquée en trait vert. Les sites de phosphorylation rapportés sont indiqués par des lignes rouges [81, 99]. Les mutations du syndrome LigIV sont présentées sous les domaines [72, 100]. Les régions d'interaction Ku et XRCC4 sont indiquées par des crochets noirs [29, 84, 94].

De nombreuses enzymes de la superfamille des nucléotidyltrasférases ont des domaines supplémentaires en plus des domaines centraux catalytiques conservés. N-terminal à la NTase, par exemple, les ADN ligases humaines ont un domaine de liaison à l'ADN (DBD), dont la structure tridimensionnelle a été découverte pour la première fois par Pascal et al. (2004) avec les domaines catalytiques de l'ADN ligase I humaine (LigI) complexés avec un fragment d'ADN entaillé non ligaturable [73]. Ce domaine est également présent dans les ADN ligases archées [74–76] et peut-être dans d'autres ADN ligases eucaryotes, poxvirus et archées [77]. Pascal et al. (2004) ont montré que le DBD est essentiel pour que LigI se lie à l'ADN et effectue la ligature des coupures d'ADN [73]. Cependant, cela ne semble pas être le cas pour l'ADN ligase III [78], bien que l'essentiel de l'affinité de liaison à l'ADN de LigIV semble provenir de sa DBD (T Ochi et TL Blundell, résultats non publiés). Ces résultats suggèrent que les DBD de chaque ADN ligase humaine ont des propriétés de liaison à l'ADN différentes, bien qu'elles soient susceptibles d'avoir des structures similaires [79]. Deux mutations du syndrome LigIV ne sont sévères que lorsqu'elles sont associées à R278H, et elles semblent avoir peu d'impact sur l'activité de LigIV [37]. Sur la base des similitudes structurelles des régions catalytiques de LigI et LigIV, elles sont susceptibles de se lier à l'ADN d'une manière similaire.

En plus de la région catalytique, les ADN ligases humaines ont des domaines supplémentaires [79]. LigIV a un domaine BRCT en tandem avec un lieur prédit pour être principalement désordonné. Ce linker semble être important pour l'activité catalytique de LigIV [80] et possède un site de phosphorylation à T650 par l'ADN-PKcs, dont la phosphorylation stabilise LigIV [81]. Le domaine BRCT, qui a généralement quatre brins parallèles entourés de trois hélices [82], est courant dans les protéines de point de contrôle du cycle cellulaire qui répondent aux dommages à l'ADN [83]. LigIV interagit avec XRCC4 principalement via le linker entre les deux BRCT [80]. Comme indiqué ci-dessus, en plus de l'interaction avec XRCC4, il a été démontré que le premier domaine BRCT (BRCT1) interagit avec Ku70/80 [84].

Les structures des domaines BRCT en tandem de BRCA1 et MDC1, de levure Crb2, Nbs1 et Brc1, ont été résolues avec différents phosphopeptides. Quatre résidus clés qui forment la poche de liaison de la phospho-sérine : le motif (S/T)G à la fin du premier brin (1) et le motif (S/T)XK au début de la deuxième hélice (2) [85-93] ont été identifiés, les résidus sont conservés dans le domaine BRCT en tandem de LigIV, sauf que le deuxième motif est remplacé par NXR. Ainsi, BRCT1 pourrait se lier aux phosphosérines [94], bien que les interactions avec les deux domaines BRCT proximaux trouvés dans BRCA1, MDC1, Crb2, Nbs1 et Brc1 soient peu susceptibles de se produire dans LigIV car les domaines BRCT en tandem sont probablement séparés [94, 95 ]. En effet, in vitro des expériences de liaison aux phosphopeptides ont montré que les domaines BRCT de LigIV se liaient aux phosphopeptides [96, 97]. Cependant, la séquence précise d'un phosphopeptide qui se lie aux domaines BRCT n'a pas encore été déterminée.

Étant donné que les domaines BRCT en tandem ont un arrangement globulaire commun des domaines BRCT, les domaines LigIV peuvent interagir lorsque LigIV est sous forme libre. L'interface principale de dimérisation du domaine BRCT tandem est 2 dans BRCT1, et les première et troisième hélices 1 et 3 dans le deuxième domaine BRCT (BRCT2) [98]. Fait intéressant, la surface d'interaction de ces domaines BRCT et XRCC4 est similaire à celle d'autres domaines BRCT en tandem (comme discuté ci-dessous). Il est possible qu'un domaine BRCT d'une autre protéine interagisse avec 2 de BRCT1, qui est exposé au solvant. Ainsi, bien que les domaines BRCT en tandem de LigIV aient un lieur long, ils ont des caractéristiques communes avec d'autres domaines BRCT en tandem.

2.4. XRCC4

En solution, XRCC4 existe sous la forme d'un équilibre sel-dépendant de dimères et de tétramères [102] voir figure 10. Une tétramérisation queue à queue a été observée dans les cristaux de protéine XRCC4 [103]. Liaison de LigIV avec le XRCC4 C-terminal ??-le coiled-coil hélicoïdal stabilise la formation du dimère XRCC4. La région de liaison entre XRCC4 et LigIV chevauche la région de tétramérisation de XRCC4, ce qui peut expliquer pourquoi LigIV fonctionne pour déplacer XRCC4 sous forme de dimère en solution [102]. On ne sait toujours pas si le XRCC4 tétramérique a une fonction au cours de la voie de réparation NHEJ.


Dimère, tétramère XRCC4 et liaison avec le peptide ADN ligase IV. L'équilibre est déplacé vers le dimère lorsque le peptide d'ADN ligase IV se lie à XRCC4.

La séquence protéique de XRCC4 après le résidu 213 n'est pas incluse dans les structures cristallines de XRCC4 en raison de la structure hautement désordonnée et flexible attendue du domaine C-terminal de XRCC4 [103]. Cependant, des études EM ont révélé que la structure C-terminale du XRCC4 de souris est un domaine globulaire [104]. Ce domaine comprend des séquences de localisation nucléaire putatives [105]. Ces auteurs ont également suggéré qu'un groupe d'acides aminés acides 229-238 est important pour l'activité d'auto-transcription. De plus, le domaine C-terminal du XRCC4 est la cible des protéines régulatrices du NHEJ. L'ADN-PKcs phosphoryle XRCC4 et régule sa liaison avec l'ADN [31]. Les résidus S260 et S318 dans la région C-terminale du XRCC4 ont été identifiés comme étant les principaux sites de phosphorylation par DNA-PKcs [106]. XRCC4 est également phosphorylé par CK2, résidu T233 et la phosphorylation par CK2 recrute PNK, qui est susceptible de participer à NHEJ [107]. En effet, la structure du domaine ForkHead-Associated (FHA) de PNK avec un phosphopeptide dérivé de XRCC4 a été résolue [108]. Le résidu XRCC4 K210 a également été signalé comme étant important pour la modification du petit modificateur de type ubiquitine (SUMO), qui régule la localisation cellulaire du XRCC4 [109]. La région C-terminale du XRCC4, ainsi que la région N-terminale (résidus 1-28) et la région centrale (résidus 168-200), peuvent faciliter la liaison coopérative à l'ADN [31]. Ainsi, la définition de la structure de la structure de la région C-terminale contribuera à comprendre comment XRCC4 se lie à LigIV et à l'ADN afin de remplir sa fonction.

2.5. XLF

XLF a été identifié par une étude de clonage de complémentation fonctionnelle d'ADNc du patient 2BN suite à la découverte d'un groupe de patients présentant un déficit en NHEJ (2BN) [38, 110]. Il a également été identifié de manière indépendante par criblage à deux hybrides de levure pour les interacteurs XRCC4 [39]. XLF est conservé au cours de l'évolution chez un large éventail d'eucaryotes tels que les vertébrés, les insectes et même chez les champignons filamenteux [111]. Le XLF humain complet contient 299 résidus. À son extrémité C-terminale, un petit amas basique conservé constitue la séquence de localisation nucléaire. En utilisant la coloration par immunofluorescence, XLF a été observé en se localisant dans le noyau des cellules humaines [39].

La structure cristalline de XLF avec une troncature C-terminale, résolue indépendamment à une résolution de 2,3 Å par Andres et al. [112] et dans notre laboratoire [101], existe sous la forme d'un homodimère contenant un domaine de tête N-terminal globulaire et une queue hélicoïdale enroulée étendue, qui est repliée autour de la bobine enroulée (Figure 11). Le domaine de tête N-terminal commence par une seule hélice 1, qui est suivie d'une structure antiparallèle à sept brins prenant en sandwich un motif hélice-tour-hélice entre 4 et 5. La structure de queue contient trois hélices 4, 5 et 6. Tandis que 4 s'éloigne du domaine de tête N-terminal d'environ 60 Â, 5 et 6 fois en arrière et entrent en contact avec le domaine de tête. Les 4 hélices des deux protomères interagissent comme une structure enroulée enfouissant des résidus hautement conservés et hydrophobes à l'interface. Cette dimérisation du XLF est encore renforcée par le repliement des 5 et 6 hélices pour encercler les 4 hélices de l'autre protomère pour former une pince, conduisant à l'enfouissement d'une surface de

6500 2 . La filtration sur gel, la réticulation des protéines et l'ultracentrifugation analytique sont également compatibles avec une forme homodimère stable de XLF en solution [101]. XLF s'est avéré avoir une formation de complexe d'ordre supérieur dépendante de la concentration au cours des expériences de filtration sur gel [112]. L'homodimère de XLF, cependant, est la plus petite unité fonctionnelle stable.


Structure cristalline de XLF/Cernunnos. Diagramme ruban du dimère XLF/Cernunnos. Un protomère est de couleur arc-en-ciel allant de l'extrémité N (bleu) à l'extrémité C (rouge). Adapté de Li et al. [101].

En raison de la structure désordonnée prédite pour la région XLF C-terminale après le résidu 245, environ 70 résidus ont été retirés de la XLF C-terminale dans les analyses de structure cristalline [101, 112]. L'emplacement approximatif de la région XLF C-terminale, cependant, peut être prédit comme étant proche de la région du domaine de la tête N-terminale selon la direction de l'hélice 6.

Bien que XLF et XRCC4 aient des architectures similaires, de grandes différences structurelles de la tête à la queue se produisent entre ces deux protéines. Pour le domaine de la tête, les deux protéines contiennent la même structure antiparallèle à sept brins prenant en sandwich un motif hélice-tour-hélice, mais XLF contient une hélice supplémentaire à l'extrémité N-terminale. Comme nous l'avons vu, la structure de la queue de XLF contient des hélices distinctes qui se replient, tandis que la structure de queue étendue en spirale de XRCC4 contient la région de liaison LigIV près de l'extrémité C-terminale. Les différences de séquence et de structure entre les queues XLF et XRCC4 expliquent pourquoi LigIV ne se lie pas à XLF de la même manière que XRCC4.

Les fonctions et les mécanismes d'action de XLF dans NHEJ ne sont pas encore entièrement compris. XLF stabilise non seulement LigIV/XRCC4 aux extrémités cassées de l'ADN, mais améliore également le processus de jonction des extrémités LigIV/XRCC4. XLF s'est également avéré essentiel pour réparer les surplombs mésappariés et le processus de remplissage des espaces avec l'ADN polymérase pol et pol [113, 114]. Comprendre comment XLF fonctionne dans NHEJ en étudiant son interaction structurelle avec d'autres protéines NHEJ aidera à démêler le rôle exact de XLF. Cela contribuera à notre compréhension actuelle de la réparation de l'ADN dans le NHEJ et pourrait également potentiellement conduire à une future application thérapeutique pour les patients atteints de défauts du NHEJ.

3. Biologie structurale des complexes

3.1. Complexe ternaire ADN-PKcs/Ku70/Ku80/ADN (ADN-PK)

La structure cristalline de l'hétérodimère Ku70/80 n'inclut pas le domaine d'interaction ADN-PKcs C-terminal de Ku80 (Ku80CTD), qui est superflu pour la liaison de Ku70/80 à l'ADN mais est nécessaire pour le recrutement de l'ADN-PK sur les sites d'ADN endommagé [13, 14]. L'analyse par résonance magnétique nucléaire de 19 kDa Ku80CTD (résidus 545–732) définit une structure en hélice [115, 116]. D'autres études structurelles de Ku70/80 pleine longueur avec et sans ADN ont été menées en utilisant la microscopie électronique à particule unique (EM) [117] et SAXS combinée à l'imagerie de cellules vivantes [63]. La position de Ku80CTD a été proposée comme étant sous le domaine / de Ku70 par EM, mais le domaine s'est avéré flexible dans l'étude SAXS. Des simulations de dynamique moléculaire de Ku80CTD ont produit un ensemble de conformations, soutenant l'idée que Ku80CTD est une région de haute flexibilité [63]. Prises ensemble, les études montrent que l'association de Ku70 et Ku80 pour former un hétérodimère est nécessaire pour lier les extrémités de l'ADNdb, que la liaison à l'ADN dépendant de Ku entraîne le recrutement de l'ADN-PKcs et que cette dernière interaction implique le domaine hélicoïdal situé au C- terminus de Ku80. Bien que Ku80CTD ait été inclus dans la structure cristalline de l'ADN-PKcs, sa position n'a pas pu être définie sans équivoque, probablement en raison de la dominance de structures alpha hélicoïdales similaires dans l'ADN-PKcs lui-même [48].

Des informations sur les structures des holoenzymes DNA-PKcs/Ku70/Ku80 et les complexes synaptiques possibles ont été obtenues en utilisant la cryomicroscopie électronique et le SAXS. Boskovic et al. (2003) ont utilisé la microscopie électronique à basse résolution (30 ) pour démontrer d'importants changements de conformation dans l'ADN-PKcs humain lorsque l'ADN double brin se lie, et ont suggéré que cela pourrait être en corrélation avec l'activation de la kinase [118]. Par la suite, Spagnolo et al. (2006) ont utilisé la microscopie électronique à particule unique à une résolution de 25 Å pour étudier l'holoenzyme ADN-PKcs/Ku70/Ku80 humaine assemblée sur l'ADN [16]. Ils ont à nouveau trouvé des preuves de changements de conformation lors de la liaison de Ku et d'ADN à l'ADN-PKcs. Ils ont identifié des particules dimères comprenant deux holoenzymes DNA-PKcs/Ku70/Ku80, qu'ils considèrent comme étant probablement des complexes synaptiques, maintenant les extrémités cassées et fournissant une plate-forme pour d'autres composants nécessaires au traitement final et à la ligature. Une étude SAXS de l'ADN-PK a révélé qu'elle avait deux modes de dimérisation différents, comme cela avait été observé précédemment avec l'ADN-PKcs [63]. Selon la présence d'ADN en épingle à cheveux de 40 pb ou d'ADN en forme de Y de 40 pb, l'ADN-PK a formé le dimère tête à tête ou paume à paume. Très récemment Perry et al. (2010) ont poussé l'étude de l'holoenzyme DNA-PKcs/Ku70/Ku80 plus loin en analysant leurs études SAXS antérieures à la lumière de la structure cristalline de l'ADN-PKcs [119]. Ils ont démontré de manière impressionnante que la phosphorylation de l'ADN-PK provoque un changement conformationnel important, suffisant pour ouvrir l'espace dans l'anneau et permettre l'accès ou la libération de l'ADN. Ku80CTD s'est avéré flexible et s'étendait en solution au profit du recrutement de DNA-PKcs. Il est possible que Ku80 interagisse avec l'ADN-PKcs des deux côtés de la BSB [63].

3.2. Complexes ADN ligase IV/XRCC4

LigIV est stabilisé en formant un complexe serré avec XRCC4 [28]. Environ 99 % de LigIV est préadénylée lorsqu'elle est purifiée avec XRCC4 et il est difficile de réényler après une ligature simple [120], ce qui implique que le complexe LigIV/XRCC4 est prêt à ligaturer l'ADN. Contrairement à d'autres ADN ligases humaines, LigIV/XRCC4 peut ligaturer efficacement l'une des entailles d'un DSB, bien que l'autre ne soit pas ligaturable [26], et elle peut ligaturer des brins d'ADN à travers des espaces et des extrémités totalement incompatibles [121]. De plus, il a été montré que LigIV peut ligaturer l'ADN poly-T simple brin [122]. Fait intéressant, l'efficacité de la ligature est plus élevée avec de longs substrats d'ADN

53 pb [123]. Cela pourrait être lié à l'observation qu'un seul LigIV/XRCC4 relie deux extrémités d'ADN [124].

Les structures cristallines du dimère XRCC4 complexé avec le domaine BRCT en tandem de LigIV montrent que le lieur entre les deux domaines BRCT est bien ordonné et forme une pince hélice-boucle-hélice (HLH) autour de la bobine enroulée [29, 94] ( Figures 12(a) et 12(b)). Le même mode d'interaction et l'arrangement de la structure secondaire sont observés dans le complexe de levure orthologue entre XRCC4 (Lif1p) et LigIV (Lig4p) [95] (Figure 12(c)). Les deux domaines BRCT dans les complexes humains et de levure étendent le clamp, encerclant le domaine coiled-coil. Les

-l'hélice dans BRCT1 est située à proximité de la région d'interaction XRCC4 conservée du lieur (XIR : résidu 748-784) entre deux domaines BRCT. L'hélice correspondante dans BRCT1 de 53BP1 participe à la surface d'interaction de p53 [125, 126]. L'interaction de XRCC4 avec LigIV produit un pli dans une hélice de la bobine enroulée du dimère XRCC4 et transforme la répétition heptade gauche en une bobine enroulée droite non décadée en conséquence, la surface d'interaction LigIV devient plate [29, 94]. Le coude se plie dans la direction opposée dans le complexe entre XRCC4 avec XIR et avec le domaine BRCT en tandem [94]. La première structure pourrait être un état intermédiaire de l'interaction LigIV/XRCC4.Si tel est le cas, ce changement de conformation dynamique pourrait avoir un rôle biologique in vivo. Ce pli n'apparaît pas dans Lif1p/Lig4p même si le raffinement de la structure contre un nouveau jeu de données de diffraction 3,5 Å a été effectué (voir [127], T Ochi et TL Blundell, résultats non publiés). Ainsi, le pli peut être unique à l'homme et à certains autres organismes supérieurs.


Structures cristallines de LigIV/XRCC4 et Lif1p-Lig4p. La région d'interaction XRCC4 ou Lif1 conservée de LigIV (XIR) ou Lig4p (LIR) est indiquée par des flèches bleues. (a) XRCC4 (résidus 1-213) (bleu) et XIR (violet) (code PDB : 1IK9). (b) Domaines XRCC(résidus 1–203)(bleu) et BRCT de LigIV(résidus 654–911)(violet) (code PDB : 3II6) (c) Domaines Lif1p(résidus 1–246)(bleu) et BRCT de Lig4p(résidus 680–944)(violet).

La deuxième hélice dans HLH médie une interaction hydrophobe avec le côté opposé de la surface plane du XRCC4 à l'endroit où XIR interagit [94] et une interaction hydrophobe étendue similaire est observée dans Lif1p/Lig4 (résidus 827–839) [95]. LigIV interagit en outre avec le coiled-coil de XRCC4 via 1 et 3 de BRCT2, d'une manière qui ressemble à l'interaction entre BRCT1 et BRCT2 d'autres domaines BRCT en tandem. La superposition de LigIV/XRCC4 et Lif1p/Lig4p sur la base de XIR et de la région correspondante de Lig4p (LIR) montre que, outre le pli décrit ci-dessus, un autre changement se produit dans la position de BRCT1 (Figure 13). Cela peut être un artefact cristallographique car BRCT1 est étroitement emballé avec BRCT2 appartenant à une autre molécule dans les structures humaines et de levure. Cependant, la structure RMN de BRCT1 (code PDB : 2E2W) a la même conformation que celle cristallographique, suggérant au moins BRCT1 humain et le linker suivant est susceptible d'avoir la même conformation en solution.


Comparaison des positions de BRCT1 entre LigIV/XRCC4 et Lif1p/Lig4p. Les structures de LigIV/XRCC4 (violet/argent) et Lifp1/Lig4p (vert/or) ont été superposées sur la base de XIR et LIR. La figure est une vue de la direction terminale C à N des bobines enroulées de XRCC4 et Lif1p. Les N-terminaux et les hélices de BRCT1 de LigIV et Li4p sont marqués respectivement au violet et au vert.

Une structure EM récemment publiée du complexe LigIV/XRCC4 montre le N-terminal de LigIV à proximité du domaine de tête de XRCC4 [128]. Les auteurs ont comparé deux constructions LigIV/XRCC4, l'une avec les séquences complètes et l'autre avec une LigIV complète et un XRCC4 tronqué (résidus 1-213). A partir des différences des deux images EM, ils ont déterminé la position de l'extrémité C-terminale de XRCC4 et en marquant l'étiquette hexahistidine avec de l'or, ils ont identifié l'extrémité N-terminale de LigIV. Bien que les auteurs aient reconstruit des images moyennes 2D de LigIV/XRCC4, la reconstruction 3D a échoué en partie en raison de l'hétérogénéité de la conformation LigIV/XRCC4. Ainsi, ils ont proposé que la région catalytique de LigIV soit connectée à la région C-terminale par un linker flexible et cela peut avoir une importance fonctionnelle (voir aussi Perry et al. (2010) [119]).

Nous avons réalisé des études SAXS du domaine BRCT en tandem de LigIV/XRCC4 muté (BmX4) et LigIV/XRCC4 muté (LmX4) afin d'étudier la conformation de la région catalytique en solution (Figure 14(a)) [129]. Ici, XRCC4 muté est identique à celui utilisé pour résoudre la structure de XIR/XRCC4 [29]. La linéarité des graphiques de Guinier respectifs a confirmé que les solutions de protéines étaient homogènes et monodisperses (figure 14(b)). Le rayon de giration déduit et la dimension moléculaire maximale de LmX4 sont respectivement 9 et 43 plus grands que ceux de BmX4. Le profil de diffusion simulé utilisant la structure cristallographique de BmX4 (code PDB : 3II6) correspondait bien à la courbe SAXS mesurée (

, données non présentées). De plus, le ab initio La restauration de forme 3D de BmX4 a reproduit une conformation globale cohérente avec la structure cristalline (Figure 14 (c)). Les ab initio La reconstruction de la forme de LmX4 a révélé que la région catalytique peut contribuer à une densité supplémentaire du domaine de tête de XRCC4 ou du domaine BRCT en tandem de LigIV par rapport à la conformation de BmX4 (Figure 14 (c)). Étant donné que la conformation étendue et ouverte de la région catalytique en solution a également été observée dans une ADN ligase d'archées [74], la densité supplémentaire peut correspondre à une conformation similaire de la région catalytique de LigIV à la conformation fermée observée dans d'autres ADN ligases d'archées. [75, 76]. Comme les restaurations de forme de LmX4 ont donné une conformation reproductible (également indiquée par la valeur de divergence spatiale normalisée (NSD) après moyennage de forme), cette découverte pourrait impliquer des interactions entre la région catalytique et BmX4. Cependant, le test de déplacement de mobilité électrophorétique et l'analyse de la protéase (données non présentées) indiquent qu'il est peu probable que la région catalytique ait de fortes interactions avec BmX4. Ainsi, bien que la majorité de LmX4 en solution puisse avoir la conformation ouverte étendue, la région catalytique est attachée de manière flexible à BmX4. Nos observations sont en accord avec l'étude EM [128].


. (b) Diagrammes de Guinier de LmX4 et BmX4 avec ajustements de la doublure (ligne rouge)

3.3. Complexes XLF/XRCC4

L'interaction entre XLF et XRCC4 est sensible au sel, elle ne dépend pas de l'ADN [39, 133] et les interactions se produisent à travers les régions de la tête, comme le montre l'étude sur deux hybrides de levure de divers mutants [134]. XLF lié à des billes à son C-terminal était toujours capable d'abaisser LigIV/XRCC4, ce qui implique que le C-terminal de XLF n'est pas important pour l'interaction avec LigIV/XRCC4 [135].

Des études de mutagenèse indiquent que le résidu XLF L115 structurellement exposé (figure 16 en vert) situé dans la boucle 6-7 est important pour l'interaction XLF/XRCC4 [112]. Les résidus K63, K65 et K99 (figure 15 en vert) de XRCC4 sont essentiels pour l'interaction et sont situés sur la région du domaine de la tête proche de la queue hélicoïdale [112]. Les résidus d'interaction non essentiels de XLF sont principalement situés en dehors de la région de la tête, tandis que les résidus de liaison non essentiels de XLF/XRCC4 dans XRCC4 sont principalement situés sur la face supérieure du domaine de la tête N-terminal et sur la structure de la queue hélicoïdale avant la région de liaison LigIV (Figures 15 et 16 représenté en gris) [112]. Ces études sont cohérentes avec un modèle d'interaction linéaire côte à côte, dans lequel les domaines de tête XLF glissent dans l'espace créé par les domaines de tête XRCC4 et la partie N-terminale de la structure de la queue [112] (Figure 17). Cependant, nous ne pouvons pas exclure un modèle pour XLF/XRCC4, impliquant XLF et XRCC4 se liant ensemble de manière côte à côte mais avec un degré de torsion introduisant une courbure et éventuellement un complexe circulaire. Cela aurait l'avantage de former un complexe fini et discret. D'autres expériences de diffusion des rayons X aux petits angles peuvent être la meilleure approche pour résoudre ce problème, en particulier si les complexes sont dynamiques, comme le suggèrent les expériences de filtration sur gel. Cependant, l'observation selon laquelle des complexes XLF/XRCC4 ont été cristallisés et des données radiographiques collectées, bien qu'à faible résolution (Q Wu, TL Blundell, données inédites), encouragent l'identification de complexes bien définis.




3.4. Disposition spatiale des complexes d'ordre supérieur

Afin de donner une image de l'organisation spatiale et temporelle du système de réparation NHEJ dans son ensemble, une compréhension de l'ordre des interactions lors de l'assemblage du complexe ternaire DNA-PKcs/Ku70/Ku80/DNA et du LigIV/XRCC4/ Le complexe quaternaire XLF/ADN sera indispensable.

Ku70/80 et DNA-PKcs, qui ont une affinité de liaison à l'ADN plus élevée que LigIV/XRCC4/XLF, forment très probablement le complexe ternaire DNA-PKcs/Ku70/Ku80/DNA en premier. Pour la formation suivante du complexe LigIV/XRCC4/XLF/ADN, l'ordre et la dynamique de l'assemblage des protéines restent à déterminer. L'interaction entre XRCC4 et XLF est relativement faible par rapport à la forte liaison entre XRCC4 et LigIV. Il n'est pas clair si les interactions XLF-dimères avec XRCC4-dimères sont maintenues lorsque la ligase est recrutée. Des tests d'interaction protéique ont confirmé le recrutement XLF indépendant de XRCC4 vers les DSB se termine par interaction avec Ku70/80 uniquement en présence d'ADN. Cela peut impliquer que XLF peut agir indépendamment sans XRCC4.

Les techniques d'imagerie des cellules vivantes ont identifié le recrutement immédiat de XLF dans les DSB induites par laser avec la protéine Ku70/80 liée [136]. Le XRCC4 est superflu pour le recrutement XLF aux extrémités de l'ADN, mais sa présence peut stabiliser l'interaction XLF/ADN [136]. Des tests d'interaction protéique ont confirmé l'interaction entre Ku70/80 et XLF, et cette interaction ne se produit qu'en présence d'ADN [136].

XRCC4 et XLF nécessitent tous deux un long morceau d'ADN pour la liaison. La manière dont l'ADN est structurellement impliqué dans tous les complexes protéiques d'ordre supérieur est d'un intérêt fondamental. La phosphorylation de LigIV, XRCC4 et XLF par DNA-PKcs n'interfère pas beaucoup avec les fonctions centrales de ces protéines, mais pourrait modifier les affinités de liaison relatives de diverses interactions protéine-protéine ou protéine-ADN, qui sont importantes pour un arrangement spatial correct des complexes d'ordre supérieur. Toutes ces incertitudes soulignent la nécessité de poursuivre les études pour caractériser les complexes dans le temps ainsi que dans l'espace.

4. Discussion

Les défis de la caractérisation structurelle des systèmes multiprotéiques dynamiques exigent clairement une combinaison de SAXS, EM, cristallographie aux rayons X et autres approches. Tous seront avantagés par des méthodes de stabilisation et de fixation des complexes. Les constructions modifiées, par exemple, la mutation et la troncature mimant la phospho ainsi que la post-modification, par exemple, la phosphorylation et la méthylation, doivent être explorées afin d'identifier des complexes stables. Pour les études cryo-EM sur une seule particule, GraFix a été introduit avec succès pour stabiliser les macromolécules [137]. Cela exploite la centrifugation en gradient de glycérol en concentrations croissantes de réactif de fixation chimique pour stabiliser les macromolécules individuelles et empêcher l'agrégation opportuniste. Une approche similaire pourrait être utilisée pour d'autres études structurelles, y compris la cristallographie aux rayons X, bien qu'ici, la modification de la surface moléculaire des complexes puisse empêcher la formation de cristaux ordonnés.

Les cristaux de grands assemblages multiprotéiques adaptés à la diffraction des rayons X à haute résolution restent un défi. Le développement de méthodes d'analyse des données de diffraction des rayons X à basse résolution est donc essentiel. À cet égard, les sources de lumière laser à électrons libres (FEL) peuvent permettre une imagerie FEL à rayons X (XFEL) à particules uniques. La cristallographie aux rayons X avec des nanocristaux est également une méthode prometteuse.

La cristallographie aux rayons X est encore la seule technique à donner une résolution atomique de grandes structures et une haute résolution est essentielle pour étudier la liaison de petites molécules. En effet les outils chimiques qui permettent une intervention spécifique dans le NHEJ devraient permettre de dissection des rôles des différents composants. Ces outils contribueraient également probablement à la découverte de composés phares et de candidats précliniques pour une intervention thérapeutique au niveau des sites d'interaction allostérique et d'autres interactions réglementaires en oncologie et pour les patients présentant des défauts dans la voie NHEJ.

L'intérêt immédiat, se développant à partir de la structure émergente de l'ADN-PKcs, est l'amélioration de la conception d'inhibiteurs qui se lient au site ATP de la fraction protéine kinase. De tels inhibiteurs informeraient non seulement le développement d'agents thérapeutiques utiles, mais devraient également être d'une valeur immédiate pour étudier la possibilité d'améliorer la stabilité du domaine kinase, ainsi que la qualité et la résolution des cristaux.

À terme, nous espérons poursuivre une approche guidée par la structure pour optimiser la conception de tels inhibiteurs. Des approches similaires pourraient être adoptées avec le site actif de la ligase. À notre avis, une approche plus excitante et aventureuse serait de concevoir de nouvelles entités chimiques qui se lient aux sites allostériques, aux modèles ou aux sites de liaison d'adaptateurs - ce qu'on appelle l'allo-ciblage - qui sont essentiels à l'activation, la colocalisation et/ou la spécificité de la régulation de NHEJ. L'utilisation de méthodes basées sur les fragments [138-140] dans ce contexte est intéressante. Les cibles probables seraient les interactions directes de XRCC4 et XLF, les interactions des domaines BRCT et l'interaction de Ku70/80 et de l'ADN-PKcs.

En conclusion, une compréhension spatiale et temporelle de NHEJ devrait fournir des informations sur le mécanisme de ce processus cellulaire critique et également suggérer des approches pour concevoir des outils chimiques utiles. En effet, la conception de petits agents chimiques qui modulent de manière non covalente les interactions contribuerait également probablement à la découverte de composés phares permettant une intervention thérapeutique en oncologie et le traitement de patients présentant des défauts de la voie NHEJ.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr J. Günter Grossmann pour les discussions et les commentaires utiles sur les données SAXS. B. L. Sibanda et D. Y. Chirgadze ont été soutenus par la subvention du programme Wellcome Trust : 079281/Z/06/Z. T. Ochi a été soutenu par Overseas Research Studentship (ORS). Les graphiques moléculaires, à l'exception des figures 4 et 14, ont été préparés en utilisant PyMOL [141].

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Droits d'auteur

Copyright © 2010 Takashi Ochi et al. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'œuvre originale soit correctement citée.


Biologie des cellules souches et aspects cancérogènes de la protection radiologique

Citation recommandée
CIPR, 2015. Biologie des cellules souches en ce qui concerne les aspects de cancérogenèse de la protection radiologique. Publication CIPR 131. Ann. CIPR 44 (3/4).

Auteurs au nom de la CIPR
O. Niwa, M.H. Barcellos-Hoff, R.K. Globus, J.D. Harrison, J.H. Hendry, P. Jacob, M.T. Martin, T.M. Graine, J.W. Shay, M.D. Histoire, K. Suzuki, S. Yamashita

Résumé - Ce rapport fournit un examen des cellules souches/cellules progénitrices et de leurs réponses aux rayonnements ionisants en relation avec les problèmes liés aux effets stochastiques des rayonnements qui constituent une partie importante du système de protection radiologique de la Commission internationale de protection radiologique. Les informations actuelles sur les caractéristiques, le maintien et le renouvellement des cellules souches, l'évolution avec l'âge, la localisation dans les niches de cellules souches et la radiosensibilité aux expositions aiguës et prolongées sont présentées dans une série de revues substantielles sous forme d'annexes concernant le tissu hématopoïétique, la glande mammaire, la thyroïde, le système digestif. des voies respiratoires, des poumons, de la peau et des os. Cette base de connaissances sur les cellules souches est utilisée dans le texte principal du rapport pour fournir un aperçu biologique de problèmes tels que le modèle linéaire sans seuil (LNT), le risque de cancer parmi les tissus, les effets du débit de dose et les changements dans le risque. de la cancérogenèse radiologique selon l'âge à l'exposition et l'âge atteint.
La connaissance de la biologie et de la radiobiologie associée des cellules souches et des cellules progénitrices est plus développée dans les tissus qui se renouvellent assez rapidement, tels que le tissu hématopoïétique, la muqueuse intestinale et l'épiderme, bien que tous les tissus considérés ici possèdent des populations de cellules souches.
Les caractéristiques importantes du maintien, du renouvellement et de la réponse des cellules souches sont les signaux microenvironnementaux opérant dans la résidence de niche, pour lesquels un emplacement spatial bien défini a été identifié dans certains tissus. L'identité de la cellule cible pour la cancérogenèse continue d'indiquer la population de cellules souches plus primitives qui est pour la plupart quiescente, et donc capable d'accumuler la séquence prolongée de mutations nécessaires pour entraîner une malignité. De plus, il existe un certain potentiel pour que les cellules progénitrices filles soient des cellules cibles dans des cas particuliers, comme dans le tissu hématopoïétique et dans la peau. Plusieurs processus biologiques pourraient contribuer à protéger les cellules souches contre l'accumulation de mutations : (a) réparation précise de l'ADN (b) mort rapide des cellules souches lésées (c) rétention du brin de matrice parentale d'ADN pendant les divisions dans certains systèmes tissulaires, de sorte que les mutations sont transmis aux cellules de différenciation filles et non retenus dans la cellule parentale et (d) la compétition des cellules souches, par laquelle les cellules souches non endommagées l'emportent sur les cellules souches endommagées pour la résidence dans la niche. La réparation de l'ADN se produit principalement dans les quelques jours suivant l'irradiation, tandis que la compétition des cellules souches nécessite des semaines ou plusieurs mois selon le type de tissu.
Les processus susmentionnés peuvent contribuer aux différences de valeurs de risque de rayonnement cancérigène entre les tissus et peuvent aider à expliquer pourquoi un tissu à réplication rapide tel que l'intestin grêle est moins sujet à un tel risque. Les processus fournissent également un aperçu mécaniste pertinent pour le modèle LNT et les modèles de risque relatif et absolu. Les connaissances radiobiologiques fournissent également un éclairage scientifique sur les discussions sur le facteur d'efficacité de dose et de débit de dose actuellement utilisé dans les directives de radioprotection. De plus, les informations biologiques contribuent aux raisons potentielles de la sensibilité liée à l'âge à la cancérogenèse radiologique, y compris les effets de l'exposition in utero.


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Les fondements technologiques de l'ingénierie du génome

L'ingénierie du génome est rendue possible en exploitant les voies de réparation de l'ADN de la cellule (examinées dans [5]). La plupart des techniques d'ingénierie du génome dirigent la réparation des cassures double brin (DSB) de l'ADN, qui sont introduites dans le génome au niveau ou à proximité du site où une modification de la séquence d'ADN est souhaitée. Les DSB ciblés sont obtenus à l'aide de nucléases spécifiques à la séquence (SSN) - des enzymes qui reconnaissent et clivent le locus cible avec une spécificité élevée. La réparation de la cassure peut être dirigée pour créer une variété de modifications de séquences d'ADN ciblées, allant des délétions d'ADN à l'insertion de grands réseaux de transgènes.

Il existe actuellement quatre grandes classes de SSN : les endonucléases ou méganucléases à tête chercheuse modifiées, les nucléases à doigt de zinc (ZFN), les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN) et les répétitions palindromiques courtes régulièrement intercalées (CRISPR)/réactifs Cas9 (Figure 1). Les méganucléases sont des enzymes naturelles qui se lient et clivent de grandes cibles de séquences d'ADN (de 12 à 40 pb) (Figure 1A) [6],[7]. Les méganucléases peuvent être conçues pour reconnaître de nouveaux sites, cependant, les changements dans la spécificité du site cible sont difficiles à obtenir et entraînent souvent une réduction de l'activité catalytique, ce qui a entravé leur utilisation généralisée [7]. Les ZFN, en revanche, se lient à l'ADN via un ensemble de protéines à doigt de zinc modifiées, qui sont fusionnées au domaine catalytique de l'endonucléase FokI (Figure 1B) [8],[9]. FokI fonctionne comme un dimère, et le clivage se produit donc lorsque deux ZFN lient leurs cibles et rapprochent les monomères FokI. Les TALEN sont similaires aux ZFN en ce sens qu'ils ont un domaine de liaison à l'ADN fusionné à FokI. Cependant, la reconnaissance de l'ADN par les TALEN est obtenue grâce à des matrices du motif effecteur TAL (Figure 1C) [10], [11]. Le motif effecteur TAL est hautement modulaire et pratiquement toutes les séquences d'ADN peuvent être ciblées avec des TALEN avec une efficacité élevée, ce qui les rend plus faciles à concevoir que les ZFN. L'ajout le plus récent à l'arsenal SSN est le système CRISPR/Cas9. Avec CRISPR/Cas9, le ciblage est réalisé grâce à un ARN guide qui s'apparie avec une séquence cible chromosomique spécifique (Figure 1D) [12], [13]. Le complexe ARN/ADN résultant est ensuite clivé par la nucléase Cas9. Le ciblage de l'ADN par appariement de bases évite la nécessité de concevoir un doigt de zinc spécifique à la séquence ou une matrice d'effecteurs TAL, et par conséquent, les réactifs CRIPSR/Cas9 sont rapidement en train de devenir le SSN de choix. Alors que la capacité de concevoir des SSN avec la spécificité d'ADN requise a longtemps été un goulot d'étranglement pour l'ingénierie du génome, le ciblage de l'ADN peut désormais être réalisé avec une efficacité beaucoup plus grande. Certes, de nombreux défis subsistent en termes de livraison de réactifs d'ingénierie génomique aux cellules végétales, mais les progrès sur ce front progressent également à un rythme rapide [14],[15].

(A) La méganucléase, I-Scel, est montrée liée à sa cible d'ADN. Le domaine catalytique, qui détermine également la spécificité de la séquence d'ADN, est indiqué en rouge. (B) Un dimère ZFN est illustré lié à l'ADN. Les cibles ZFN sont liées par deux domaines de liaison à l'ADN en doigt de zinc (bleu foncé) séparés par une séquence d'espacement de 5 à 7 pb. Le clivage FokI se produit à l'intérieur de l'espaceur. Chaque doigt de zinc reconnaît généralement 3 pb. (C) Représenté est un dimère TALEN lié à l'ADN. Les domaines de liaison à l'ADN sont en bleu foncé. Les deux sites cibles TALEN sont généralement séparés par une séquence d'espacement de 15 à 20 pb. Comme les ZFN, les matrices de répétition effectrices TAL sont fusionnées à FokI. Chaque motif effecteur TAL reconnaît une base. (D) Le système CRISPR/Cas9 reconnaît l'ADN par appariement de bases entre les séquences d'ADN sur le site cible et un ARN guide basé sur CRISPR (ARNg). Cas9 possède deux domaines de nucléase (indiqués par des flèches rouges) qui clivent chacun un brin d'ADN double brin.

Comment les DSB ciblés permettent-ils des modifications précises du génome ? Une fois les cassures introduites dans le chromosome, un mécanisme de réparation des cassures est la jonction terminale non homologue (NHEJ) (Figure 2A) [16], [17]. Bien que NHEJ soit souvent précis, de petites délétions ou plus rarement des insertions peuvent être introduites à la jonction du chromosome nouvellement rejoint. Si la modification de séquence provoque une mutation de décalage du cadre de lecture ou altère des résidus d'acides aminés clés dans le produit du gène cible, une mutation knock-out (perte de fonction) peut être créée. Les extrémités brisées des chromosomes peuvent également être jointes à d'autres molécules d'ADN qui sont introduites dans la cellule simultanément avec le SSN. La capture de séquences d'ADN hétérologues peut être utilisée pour obtenir un knock-in de gène ciblé (insertion ciblée) (figure 2A). Enfin, si deux cassures sont introduites dans le chromosome simultanément, des délétions de gènes ciblées ou d'autres réarrangements peuvent en résulter (figure 2B). La réparation de l'ADN par NHEJ est clairement un moyen puissant pour obtenir des modifications ciblées des séquences d'ADN.

(A) La réparation médiée par NHEJ peut entraîner de petites délétions ou insertions sur les sites cibles qui peuvent perturber la fonction des gènes (knock-outs, à gauche). Des fragments d'ADN peuvent être insérés via une ligature médiée par NHEJ pour créer des insertions ciblées (knock-ins, à droite). (B) Lorsque deux coupes sont effectuées par des SSN, la réparation médiée par NHEJ peut entraîner des délétions ou des inversions de grandes régions génomiques (à gauche) ou des délétions de gènes ciblées ou des translocations chromosomiques (à droite). (C) La réparation médiée par les RH, impliquant une matrice d'ADN homologue, conduit au remplacement ou à l'insertion de gènes.

La recombinaison homologue (HR) est un moyen alternatif de réparer un chromosome cassé. En RH, une matrice de réparation est utilisée comme source d'informations sur la séquence d'ADN qui est copiée sur le chromosome cassé pour restaurer son intégrité (Figure 2C) [18], [19]. La RH peut être exploitée pour obtenir des modifications ciblées de la séquence d'ADN en introduisant dans la cellule à la fois un SSN et une matrice de réparation d'ADN avec une similitude de séquence avec le site de rupture (ce processus est appelé ciblage génique). La variation de séquence qui est portée par la matrice de réparation est copiée par HR dans le chromosome, réalisant ainsi une modification ciblée de la séquence d'ADN. Parce que l'utilisateur spécifie le type de variation de séquence dans les modèles de réparation, HR offre de nombreuses possibilités pour manipuler les génomes des plantes. Par exemple, des knock-ins de gènes ciblés peuvent être obtenus en utilisant des matrices de réparation d'ADN avec un ou plusieurs transgènes flanqués de séquences homologues au site cible. Des modifications plus subtiles de la séquence d'ADN peuvent également être obtenues, y compris des altérations des résidus d'acides aminés clés dans la séquence codante d'un gène, ou des modifications des éléments promoteurs ou d'autres motifs agissant en cis qui contrôlent l'expression des gènes. Ainsi, la réparation de l'ADN par HR offre une capacité sans précédent à manipuler le génotype d'une plante et par conséquent son phénotype.


3.4 : Réparation de l'ADN - Biologie

Le but de ce lieu est de devenir un point de rencontre ouvert pour ceux qui s'intéressent aux études impliquant la fonction et la dynamique des génomes. Elle est prise en charge par les Laboratoires et Unités de Recherche du CABIMER travaillant sur les facteurs et mécanismes qui conforment la Biologie du Génome. Il couvre des sujets de recherche tels que la réplication de l'ADN, la réparation de l'ADN, la recombinaison de l'ADN, la ségrégation des chromosomes, la transcription, l'épigénétique, la génomique fonctionnelle et structurelle, le contrôle du cycle cellulaire et la réponse aux dommages de l'ADN, en mettant l'accent sur les approches consacrées à la compréhension du vieillissement, du cancer et des maladies génétiques.

Toute personne intéressée par le domaine, avec une attention particulière aux étudiants en sciences de la vie (biologie, biomédecine, biotechnologie, biochimie, médecine, pharmacie, chimie, vétérinaire, etc.) et aux professionnels qui souhaitent approfondir ou mettre à jour leurs connaissances ou envisagent de démarrer ou poursuivre une carrière scientifique en biologie du génome sont les bienvenus pour participer à ce projet.

-2014. Juin. 2ème Rencontre Biologie Génome du CABIMER . CABIMER, Séville, ES


Comment fonctionne l'ADN

L'ADN porte les informations nécessaires à la fabrication de toutes les protéines de la cellule. Ces protéines mettent en œuvre toutes les fonctions d'un organisme vivant et en déterminent les caractéristiques. Lorsque la cellule se reproduit, elle doit transmettre toutes ces informations aux cellules filles.

Avant qu'une cellule puisse se reproduire, elle doit d'abord reproduire, ou faire une copie de son ADN. L'endroit où se produit la réplication de l'ADN dépend du fait que les cellules sont procaryotes ou eucaryotes (voir l'encadré ARN à la page précédente pour en savoir plus sur les types de cellules). La réplication de l'ADN se produit dans le cytoplasme des procaryotes et dans le noyau des eucaryotes. Quel que soit l'endroit où se produit la réplication de l'ADN, le processus de base est le même.

La structure de l'ADN se prête facilement à la réplication de l'ADN. Chaque côté de la double hélice est opposé (anti-parallèle) directions. La beauté de cette structure est qu'elle peut se décompresser au milieu et que chaque côté peut servir de motif ou de gabarit pour l'autre côté (appelé réplication semi-conservatrice). Cependant, l'ADN ne se décompresse pas entièrement. Il se décompresse dans une petite zone appelée fourche de réplication, qui descend ensuite sur toute la longueur de la molécule.

  1. Une enzyme appelée ADN-gyrase fait une entaille dans la double hélice et chaque côté se sépare
  2. Une enzyme appelée hélicase déroule l'ADN double brin
  3. Plusieurs petites protéines appelées protéines de liaison simple brin (SSB) se lie temporairement à chaque côté et les garde séparés
  4. Un complexe enzymatique appelé ADN polymérase "parcourt" les brins d'ADN et ajoute de nouveaux nucléotides à chaque brin. Les nucléotides s'apparient avec les nucléotides complémentaires sur le stand existant (A avec T, G avec C).
  5. Une sous-unité de l'ADN polymérase relectures le nouvel ADN
  6. Une enzyme appelée ADN ligase scelle les fragments en un long fil continu
  7. Les nouveaux exemplaires remonter automatiquement

Différents types de cellules ont répliqué leur ADN à des rythmes différents. Certaines cellules se divisent constamment, comme celles de vos cheveux et de vos ongles et des cellules de la moelle osseuse. D'autres cellules passent par plusieurs cycles de division cellulaire et s'arrêtent (y compris des cellules spécialisées, comme celles du cerveau, des muscles et du cœur). Enfin, certaines cellules cessent de se diviser, mais peuvent être induites à se diviser pour réparer les blessures (comme les cellules de la peau et les cellules du foie). Dans les cellules qui ne se divisent pas constamment, les signaux de réplication/division cellulaire de l'ADN se présentent sous la forme de produits chimiques. Ces produits chimiques peuvent provenir d'autres parties du corps (hormones) ou de l'environnement.

L'ADN de tous les organismes vivants a la même structure et le même code, bien que certains virus utilisent l'ARN comme support d'information au lieu de l'ADN. La plupart des animaux ont deux copies de chaque chromosome. En revanche, les plantes peuvent avoir plus de deux copies de plusieurs chromosomes, ce qui résulte généralement d'erreurs dans la distribution des chromosomes lors de la reproduction cellulaire. Chez les animaux, ce type d'erreur provoque généralement des maladies génétiques généralement mortelles. Pour des raisons inconnues, ce type d'erreur n'est pas aussi dévastateur pour les plantes.


Voir la vidéo: DNA Replication in Eukaryotes. Elongation (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Robbie

    Pensez-vous à une phrase aussi unique?

  2. Pavlov

    Qu'en découle-t-il ?

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