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Pourquoi l'ACE2 n'est-il pas utilisé comme médicament contre le covid ?

Pourquoi l'ACE2 n'est-il pas utilisé comme médicament contre le covid ?



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L'ACE2 peut-il être produit et utilisé comme médicament contre le covid ? J'ai lu que c'était la molécule réceptrice. S'il est dans l'organisme le virus devrait s'y lier et ne pourrait plus attaquer les cellules ? Est-ce correct?


Il y a un Cellule pré-imprimé par Monteil et al. (DOI : 10.1016/j.cell.2020.04.004) qui soutient que la protéine ACE2 soluble recombinante humaine peut se lier de manière compétitive au virus SARS-CoV-2 et réduire sa capacité à infecter et à se répliquer :

Nous rapportons ici que l'ACE2 soluble recombinante humaine de qualité clinique (hrsACE2), qui a déjà été testée dans des essais cliniques de phase 1 et de phase 2 (Haschke et al., 2013, Khan et al., 2017), peut réduire la croissance virale dans Cellules Vero E6 par un facteur de 1 000 à 5 000. De plus, nous montrons que les organoïdes des vaisseaux sanguins humains et les organoïdes des reins peuvent être facilement infectés, ce qui peut être considérablement inhibé par hrsACE2 au stade précoce de l'infection.

Bien qu'il ne soit pas parfait, d'autres facteurs et récepteurs peuvent être impliqués dans l'infectiosité :

Nos données montrent maintenant que cette molécule ACE2 humaine de qualité clinique - mais pas l'ACE2 soluble chez la souris - peut inhiber de manière significative les infections par le SRAS-CoV-2 et réduire la charge virale d'un facteur de 1 000 à 5 000. Cependant, comme observé dans les expériences de neutralisation des anticorps de nombreux virus, l'inhibition n'est pas complète, bien que clairement dose-dépendante. Cela peut être dû au fait qu'il pourrait y avoir d'autres co-récepteurs/protéines auxiliaires ou même d'autres mécanismes par lesquels les virus peuvent entrer dans les cellules, comme cela avait été initialement proposé pour le SRAS (Jeffers et al., 2004 ; Qi et al., 2020 ).

Une personne a raison de dire que ce sont in vitro études. Autrement dit, ils traitent des cultures cellulaires sur l'équivalent fonctionnel d'une boîte de Pétri : des lignées cellulaires Vero ou des simulations de tissus humains (organoïdes), et ils voient ce qui se passe.

Les in vitro les études sont utiles et importantes, mais c'est un grand pas entre celles-ci et 1) traiter les gens in vivo - concevoir un médicament capable de cibler réellement et en toute sécurité le virus là où il infecte les tissus respiratoires et rénaux - et, 2) fabriquer et distribuer ce médicament en quantité, à moindre coût, en toute sécurité, etc.

Mais le point le plus important de ces études est de montrer que les scientifiques réfléchissent définitivement aux mécanismes par lesquels le virus infecte les cellules, et de voir s'il existe des moyens d'interférer et de limiter le virus, ce faisant.

Comme votre idée d'utiliser l'ACE2, certains chercheurs ont examiné d'autres virus, comme le poliovirus et le VIH, pour voir s'il existe des ligands solubles similaires qu'ils peuvent se lier aux anticorps et délivrer en toute sécurité aux humains, en tant qu'idée thérapeutique générale.

Ils ont découvert que le VIH-1, qui utilise la liaison au récepteur CD4 pour infecter les cellules T, pourrait développer une résistance mutationnelle au CD4 soluble et utiliser d'autres mécanismes pour provoquer l'infection. Mais en ajoutant un deuxième récepteur CCR5 à l'immunoglobuline, d'autres chercheurs ont pu limiter la capacité du virus VIH-1 à développer une résistance aux deux récepteurs, ce qui offre une certaine possibilité de cette approche en tant que vaccin, plus tard.

Ces problèmes compliquent tous l'utilisation des récepteurs comme moyen de « faire semblant » le virus. Mais c'est une piste à explorer, notamment pour ce virus en période d'urgence.


Les scientifiques cherchent des réponses au lien hypertension-COVID-19

BOSTON - Dans le monde de Ralph Baric, PhD, peu de coïncidences.

Il s'est donc ragaillardi quand il a vu que le SRAS-CoV-2, le virus qui cause la maladie COVID-19, pénètre dans les poumons par les récepteurs ACE2, et que les personnes souffrant d'hypertension ont des résultats pires que ceux qui souffrent de toute autre maladie sous-jacente.

"Je pensais qu'il fallait l'explorer plus en détail depuis un bon moment", a déclaré Baric, professeur d'épidémiologie, de microbiologie et d'immunologie à l'UNC Gillings School of Global Public Health à Chapel Hill, en Caroline du Nord, qui a été étudier les épidémies de coronavirus pendant des décennies.

Baric n'est pas seul. Alors que les National Institutes of Health et les entreprises privées se démènent pour tester des traitements existants et nouveaux pour COVID-19, les chercheurs et les médecins tentent de déterminer si le pic de maladie grave au COVID-19 chez les personnes souffrant d'hypertension de base est une coïncidence d'âge et de maladie générale. santé, ou s'il parle du rôle que jouent les récepteurs ACE2 dans l'hypertension et l'infection au COVID-19. Et s'il existe une association, ils veulent savoir si les inhibiteurs de l'ECA aident ou blessent les personnes les plus à risque de contracter la maladie COVID-19 sévère.

"Il est vraiment important de dire que ce sont toutes des réflexions théoriques" en ce moment, a déclaré Chris Longenecker, MD, de la Case Western Reserve University School of Medicine à Cleveland, qui a regardé la présentation de Baric à la conférence virtuelle sur les rétrovirus et les infections opportunistes (CROI) 2020 , qui est maintenant en ligne.

"Il n'y a aucune preuve que je sache qu'ils ont des avantages cliniques pour le moment", a déclaré Longenecker Actualités médicales Medscape.

Au cours de la même session, Zunyou Wu, MD, PhD, épidémiologiste en chef au Centre chinois de contrôle et de prévention des maladies, a présenté des données montrant que plus de 40 % des personnes atteintes d'une infection grave souffraient d'hypertension de base. Parmi les personnes atteintes d'une maladie grave, la deuxième comorbidité la plus courante était le diabète, à environ la moitié de ce taux. Des données similaires ont été décrites ailleurs, comme indiqué par Actualités médicales Medscape.

SRAS-CoV-2 et ACE2

Il s'avère que le SARS-CoV-2 était presque fait sur mesure pour le corps humain. Bien qu'il semble avoir émergé de chauves-souris ou d'espèces dont les chauves-souris se nourrissent, l'opinion actuelle est qu'il existe déjà un certain nombre de ces virus « de type SRAS » dans les communautés de chauves-souris qui utilisent les récepteurs ACE2 pour envahir les cellules. Les récepteurs existent dans plusieurs espèces, et chez l'homme, ils parsèment le cœur et les poumons.

De plus, ils jouent un rôle dans le développement de l'hypertension et du diabète, et sont présents en plus grand nombre chez les personnes atteintes de maladies cardiovasculaires.

Habituellement, même si un virus existe chez les chauves-souris, il faut plusieurs séries de mutations avant de passer de l'espèce hôte d'origine à une autre espèce, puis à l'homme. Et cela peut aussi prendre un certain temps pour qu'un virus passe d'une infection relativement bénigne à quelque chose qui devient épidémique.

Mais Baric et d'autres chercheurs qui ont séquencé les coronavirus de chauves-souris existants pensent maintenant que les populations de chauves-souris sont "ensemencées avec des virus préprogrammés qui ont été conçus pour utiliser plusieurs récepteurs ACE2 de chauve-souris. Par hasard, certains d'entre eux peuvent en fait utiliser directement des humains ou un réservoir secondaire. hôte", a-t-il déclaré.

En d'autres termes, les virus peuvent sauter la ligne et passer directement d'un virus de chauve-souris à un virus humain. "Et dans certains cas, ces virus peuvent être capables de se programmer directement dans la zone épidémique", a expliqué Baric.

Le fait que le SRAS-CoV-2 cible les récepteurs ACE2 pourrait être important, a déclaré Baric. Par exemple, ACE2 est sur un chromosome lié au sexe, ce qui signifie que les femmes expriment le récepteur à des niveaux plus élevés que les hommes. Mais selon les données de Wu, les hommes ont des résultats COVID-19 pires que les femmes.

Et puis il y a la question des inhibiteurs de l'ECA. Les inhibiteurs du système réinine-angiotensine-aldostérone, qui incluent les inhibiteurs de l'ECA, provoquent une augmentation de l'expression des récepteurs ACE2, selon un commentaire récent dans Avis Nature Cardiologie.

"La sécurité et les effets potentiels du traitement antihypertenseur avec des inhibiteurs de l'ECA ou des inhibiteurs des récepteurs de l'angiotensine chez les patients atteints de COVID-19 doivent être soigneusement examinés", écrivent les chercheurs chinois. « Que les patients atteints de COVID-19 et d'hypertension qui prennent un inhibiteur de l'ECA ou un antagoniste des récepteurs de l'angiotensine doivent passer à un autre médicament antihypertenseur reste controversé, et des preuves supplémentaires sont nécessaires. »

Cette expression accrue des récepteurs ACE2 a été discutée dans un récent BMJ lettre, dans laquelle des chercheurs suisses soulignent que "nous avons besoin d'études épidémiologiques et précliniques rapides pour clarifier cette relation".

S'il existe une association entre les inhibiteurs de l'ECA et le virus, « nous pourrions peut-être réduire le risque d'évolution fatale du COVID-19 chez de nombreux patients en remplaçant temporairement ces médicaments », écrivent-ils.

Cependant, il a été démontré que l'ACE2 joue un rôle protecteur dans le syndrome de détresse respiratoire aiguë induit par la grippe et, avec l'âge, l'expression de l'ACE2 diminue, a déclaré Baric, qui convient que des recherches supplémentaires sont nécessaires.

"Il existe probablement une relation directe avec le niveau d'expression de l'ACE2 et la gravité de la maladie", a-t-il déclaré. "Et cela joue probablement un rôle dans les tendances de gravité liées à l'âge" que nous avons observées dans COVID-19.

Des médicaments à petites molécules conçus pour se lier à l'ACE2 et prévenir l'infection par le SRAS ont été évalués dans une étude de 2013. "C'est une très bonne idée de revenir en arrière et de ré-explorer l'utilisation de ces médicaments, à la fois in vitro et dans des modèles animaux améliorés", a déclaré Baric.

Questions sans réponse

Pour le public du CROI, la question de l'hypertension et du COVID-19 a soulevé plus de questions que de réponses.

Après la session, Keri Althoff, PhD, de la Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health à Baltimore, a demandé, par tweet, le nombre de fumeurs dans la population signalée par Wu, et le nombre de patients prenant des médicaments antihypertenseurs, mais n'a pas encore des nouvelles de Wu, elle a dit Actualités médicales Medscape.

Longenecker a déclaré qu'il était tenté de prendre du recul par rapport à la dynamique des récepteurs ACE2 et des inhibiteurs de l'ECA, et se demande si la relation entre l'hypertension et les pires résultats du COVID-19 pourrait simplement être surreprésentée chez les personnes âgées.

"Les personnes âgées ont des taux d'hypertension plus élevés, des taux plus élevés de maladies cardiovasculaires", a-t-il déclaré. Actualités médicales Medscape. "Cela peut être une explication. Cela n'a peut-être rien à voir avec le récepteur de l'angiotensine. Quoi qu'il en soit, ce sont des choses qui méritent d'être explorées."

Épidémiologie de la COVID-19 aujourd'hui et demain

Jusqu'à présent, le SRAS-CoV-2 s'est propagé plus loin et plus rapidement que le SRAS, et il présente des caractéristiques cliniques différentes. Par exemple, Wu a montré que, contrairement à l'épidémie initiale de SRAS au début des années 2000, lorsque l'excrétion virale a commencé quelques jours après l'apparition des symptômes, l'excrétion virale du SRAS-CoV-2 peut commencer 24 à 48 heures avant l'apparition des symptômes.

"Pour les patients atteints du SRAS, le port d'un masque est suffisant pour arrêter la transmission", a expliqué Wu. « Pour COVID-19, les patients et les personnes en bonne santé doivent porter des masques pour arrêter la transmission. »

Le virus est également moins mortel que le SRAS, a déclaré John Brooks, MD, du National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and TB Prevention aux Centers for Disease Control and Prevention (CDC), lors de sa présentation.

Pourtant, compte tenu des données actuelles et selon la façon dont les États-Unis réussissent à tester et à traiter les personnes atteintes du virus, le taux de mortalité probable du COVID-19 se situera entre 0,5% et 3,5%, selon le CDC.

"COVID-19 pourrait être 5 à 35 fois plus mortel que la grippe saisonnière", a déclaré Brooks. Mercredi, Anthony Fauci, MD, directeur de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses, a déclaré lors d'une audience au Congrès qu'il s'attend à ce que COVID-19 soit 10 fois plus mortel que la grippe.

Conférence sur les rétrovirus et les infections opportunistes (CROI) 2020. Présentée le 10 mars 2020.


VOIR l'article

  • 1 Projet de neuroprotection, Centre de génie génétique et de biotechnologie, Division pharmaceutique, La Havane, Cuba
  • 2 Projet de cytoprotection, Centre de génie génétique et de biotechnologie, Division pharmaceutique, La Havane, Cuba
  • 3 Unité de soins intensifs 8B, Hôpital Hermanos Ameijeiras, La Havane, Cuba
  • 4 Direction de la recherche biomédicale, Centre de génie génétique et de biotechnologie, La Havane, Cuba

La distribution pandémique du SRAS-CoV-2 avec sa particularité d'inactiver la réponse endogène à base d'interféron et, par conséquent, d'altérer l'immunité innée, est devenue un défi pour la communauté scientifique et médicale internationale. Heureusement, les interférons recombinants en tant que produits thérapeutiques ont accumulé une longue histoire de résultats thérapeutiques bénéfiques dans le traitement de maladies virales chroniques et aiguës et également dans le traitement de certains types de cancer. L'un des premiers traitements antiviraux lors de l'apparition du COVID-19 en Chine était basé sur l'utilisation de l'interféron alfa 2b recombinant, de sorte que de nombreux cliniciens ont commencé à l'utiliser, non seulement comme thérapie mais aussi comme approche prophylactique, principalement chez le personnel médical. Dans le même temps, la recherche fondamentale sur les interférons a fourni de nouvelles connaissances qui ont contribué à une bien meilleure compréhension de la façon dont le traitement par interférons, initialement considérés comme des antiviraux, a en réalité une portée pharmacologique beaucoup plus large. Dans cette revue, nous décrivons brièvement les interférons, comment ils sont induits en cas d'infection virale et comment ils déclenchent une signalisation après contact avec leur récepteur spécifique sur les cellules cibles. De plus, certains des gènes stimulés par les interférons de type I sont décrits, ainsi que la manière dont la signalisation médiée par les interférons est torpillée par les coronavirus et en particulier par le SARS-CoV-2. Le gène de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) est l'un des gènes de réponse à l'interféron. Bien que pour de nombreux scientifiques, ce fait puisse entraîner un effet indésirable du traitement par interféron chez les patients COVID-19, l'expression de l'ACE2 contribue à l'équilibre du système rénine-angiotensine, qui est fortement affecté par le SARS-CoV-2 dans son internalisation dans la cellule. . Ce manuscrit comprend également la relation entre les interférons de type I et les neutrophiles, la NETose et l'interleukine 17. Enfin, sous le sous-titre de « messages à emporter », nous discutons de la justification d'un traitement rapide avec des interférons dans le contexte de COVID- 19 est souligné.


Fonction ACE2, distribution des récepteurs et homéostasie RAS

Le RAS en tant que voie de signalisation agit comme un régulateur homéostatique de la fonction vasculaire et, au niveau des tissus, il régule la fonction dans les organes tels que les reins, les poumons et le cœur.17 Au niveau régional, le RAS régule le flux sanguin vers les organes et contrôle les réponses trophiques à un large éventail de déclencheurs, notamment la mort cellulaire, les lésions, l'inflammation, la fibrose et la réparation vasculaire.18 Bon nombre de ces éléments régulateurs impliquent des fonctions opposées pour s'adapter à des réponses rapidement coordonnées aux stimuli locaux.

La dipeptide carboxypeptidase ACE métabolise l'angiotensine I pour former l'angiotensine II (AngII) et l'AngII est ensuite métabolisée par la carboxypeptidase ACE2 en l'angiotensine vasodilatatrice (1–7) (Ang 1–7).19 ciblant depuis plus de quatre décennies20, l'ACE2 n'a pris de l'importance que récemment en tant qu'acteur majeur du déséquilibre RAS, en particulier en présence d'une maladie. Bien que l'ACE2 partage une homologie de séquence avec le domaine extracellulaire de l'ACE, il fonctionne très différemment en tant que carboxypeptidase19 et n'est pas bloqué par les inhibiteurs de l'ECA. Par conséquent, ACE2 représente une voie de contre-régulation endogène avec RAS et agit en opposition à l'axe ACE (figure 3). En effet, dans le système cardiovasculaire, l'ACE2 peut être plus importante que l'ACE dans la régulation des effets locaux de l'AngII et de l'Ang1–7 avec des conséquences pour contrebalancer l'activation du RAS.21 22 L'AngII contribue à l'hypertension systémique et favorise localement la vasoconstriction, la dysfonction endothéliale, l'inflammation vasculaire , stress oxydatif endothélial, migration, prolifération et contraction des cellules musculaires lisses et thrombose in situ.23 24 Dans le contexte du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), l'AngII est considérée comme un acteur essentiel de la perméabilité vasculaire, de l'amplification des cytokines et de l'infiltration cellulaire inflammatoire. 21 23 24 En revanche, Ang1–7 s'oppose aux effets vasculaires locaux de l'AngII, a des effets antioxydants et anti-inflammatoires et atténue les maladies vasculaires dans les modèles murins.25

Homéostasie de RAS-ACE2 dans des conditions de santé normales10 19 perturbation de l'homéostasie de RAS-ACE2 dans les maladies cardiovasculaires, l'hypertension et le diabète sucré22 27 COVID-19 peut potentiellement réguler à la hausse le RAS chez les patients atteints de MCV et épuiser l'ACE233 proposition selon laquelle le traitement de remplacement du rhACE2 améliore l'équilibre RAS-ACE2 en augmentant l'ACE2 et diminuant l'activation du RAS.37 MCV, maladie cardiovasculaire HTN, hypertension DM, diabète sucré RAS, système rénine angiotensine rhACE2, ACE2 recombinante humaine.

Des études génétiques knock-out montrent que dans des conditions normales, une carence en ACE2 a des effets relativement modestes sur la pression artérielle, l'homéostasie cardiovasculaire et la fonction rénale par rapport à la suppression du gène ACE.26 Cependant, dans des conditions de stress oxydatif, de septicémie, d'inflammation ou d'hypertension expérimentale, de diabète, d'athérosclérose , infarctus du myocarde ou insuffisance cardiaque, le déficit en ACE2 amplifie considérablement le phénotype pathologique associé au SRA dans les modèles animaux27 et les échantillons cliniques.28 une plus grande hypertrophie cardiaque, fibrose et infarctus induits par l'AngII,30 alors que la suppression de l'ECA confère une réduction modeste de l'AngII circulante, mais aucun effet sur les niveaux tissulaires.31 Cela soutiendrait plusieurs voies non ACE pour la génération d'AngII dans le corps, mais des voies limitées pour Dégradation de l'AngII, qui met en évidence l'importance potentielle de l'ACE2 perturbation au niveau tissulaire en particulier dans les états d'activation du RAS. De plus, cela souligne le potentiel du remplacement de l'ACE2 en tant que stratégie plus puissante pour réduire l'AngII et augmenter l'Ang1-7 par rapport à l'inhibition conventionnelle du RAS.

Ainsi, dans les maladies cardiovasculaires, il existe un déséquilibre entre l'augmentation de l'activation du RAS et la réduction des effets contre-régulateurs de l'ACE2 (figure 3), ce qui peut rendre les sujets présentant une charge de risque cardiovasculaire accrue sensibles à des conditions qui aggravent les asymétries dans RAS/ACE2.


Substituer l'angiotensine-(1-7) pour prévenir les lésions pulmonaires dans l'infection par le SRAS-CoV-2 ?

Département de pharmacologie, Faculté de médecine, Universidad Autónoma de Madrid, Espagne (C.P.).

Instituto de Investigaciones Sanitarias IdiPAZ, Madrid, Espagne (C.P.).

Salvador Moncada, FRS, FMedSci, HonFBPhS, Manchester Cancer Research Centre, The University of Manchester, 555 Wilmslow Rd, Manchester M20 4GJ, Royaume-Uni

Centre de recherche sur le cancer de Manchester, Université de Manchester, Royaume-Uni (S.M.).

Comme le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV), le nouveau coronavirus SARS-CoV-2, qui est à l'origine de la maladie épidémique des coronavirus 2019 (COVID-19), pénètre dans les cellules humaines en se liant à l'enzyme de conversion de l'angiotensine-2 (ACE2) bien qu'avec une plus grande affinité. 1 Une fois attachée à ACE2, la protéine de pointe virale est amorcée par la sérine protéase hôte TMPRSS2, qui permet finalement la fusion des membranes virales et cellulaires.

L'ACE2 est une protéine clé de la branche protectrice du système rénine-angiotensine, qui convertit l'angiotensine (Ang) II, le principal peptide biologiquement actif du SRA, en son antagoniste physiologique Ang-(1-7).L'ACE2 métabolise également l'Ang I en Ang-(1-9), qui est ensuite converti en Ang-(1-7) par l'enzyme de conversion de l'angiotensine. L'Ang-(1-7) s'oppose aux actions vasoconstrictrices, pro-inflammatoires, prooxydantes, prolifératives ou profibrotiques exercées par l'Ang II via les récepteurs AT1 (Figure).

Chiffre. Diagramme représentant les principales voies métaboliques entraînées par l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE) et l'enzyme de conversion de l'angiotensine-2 (ACE2) dans le système rénine-angiotensine. Les cibles pharmacologiques des inhibiteurs de l'ECA (IEC) et des bloqueurs des récepteurs AT1 de l'angiotensine (ARA) sont également présentées. Ang indique l'angiotensine.

La liaison du SRAS-CoV à l'ACE2 régule à la baisse son expression, entraînant une augmentation de l'Ang II. 1 ACE2 est exprimé dans de nombreux organes, mais est particulièrement abondant dans les cellules épithéliales alvéolaires et les cellules endothéliales vasculaires. 2 Cela expliquerait pourquoi le poumon est particulièrement vulnérable au nouveau coronavirus. En effet, il a été démontré que la létalité du SRAS-CoV dépend de la perte de facteurs régulateurs clés dans les poumons liés à la régulation négative de l'ACE2. 3

Ang-(1-7) semble être essentiel dans la protection contre l'inflammation pulmonaire et la fibrose. Cet heptapeptide inhibe l'apoptose des cellules alvéolaires, atténue l'activation des cellules endothéliales et la perte de la fonction barrière et de l'œdème, et limite la synthèse de cytokines pro-inflammatoires et profibrotiques. Ceci est particulièrement pertinent car les lésions pulmonaires aiguës et le syndrome de détresse respiratoire aiguë s'accompagnent d'une tempête de cytokines et d'une réponse inflammatoire écrasante. 2 En effet, les cellules endothéliales activées sont de plus en plus reconnues comme les principaux orchestrateurs de la réponse inflammatoire dans le syndrome de détresse respiratoire aiguë.

L'hypertension est une comorbidité qui peut exacerber la gravité de la nouvelle infection à coronavirus. 4 Les mécanismes sous-jacents ne sont pas clairs, mais les médicaments antihypertenseurs tels que les bloqueurs des récepteurs AT1 ou les inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine augmentent l'expression de l'ACE2 dans les modèles animaux et les humains. Étant donné que l'ACE2 est le récepteur du nouveau coronavirus, il a été suggéré que chez les patients traités avec ces médicaments, l'augmentation du récepteur peut entraîner une augmentation de l'infection et donc une exacerbation de la maladie. La question de savoir si ces traitements doivent être abandonnés au profit de médicaments neutres pour l'ECA2, tels que les inhibiteurs calciques, est en cours de discussion. 5 Cependant, il n'existe actuellement aucune preuve définitive chez l'homme en faveur de cette suggestion.

D'autre part, l'effet protecteur de la surexpression de l'ACE2 est mieux compris et a conduit à l'hypothèse contrastée selon laquelle l'utilisation de bloqueurs des récepteurs AT1 pourrait protéger contre les lésions pulmonaires induites par un virus. Dans un modèle d'infection par le SRAS-CoV, le blocage des récepteurs AT1 s'est révélé efficace pour atténuer l'œdème pulmonaire et les lésions pulmonaires graves. 3 En plus d'atténuer la liaison de l'Ang II à ses récepteurs AT1, les actions bénéfiques des bloqueurs des récepteurs AT1 peuvent s'expliquer par 2 mécanismes possibles : (1) l'ACE2 restaurée, normalement diminuée au cours de l'infection virale, aide à réduire les concentrations d'Ang II, 3 et (2) il y a une génération accrue de l'Ang-(1-7) protecteur.

Plus de preuves cliniques et expérimentales sont nécessaires pour résoudre cette controverse. Pendant ce temps, nous suggérons que pendant l'infection virale, l'augmentation de la concentration d'Ang-(1-7) pourrait être vitale pour la protection contre l'activation des cellules endothéliales et les lésions pulmonaires. L'utilisation d'Ang-(1-7) ou de l'un de ses mimétiques doit être envisagée parmi d'autres stratégies pour prévenir les dommages chez les patients à haut risque.

Sources de financement

Le Dr Peiró est soutenu par une subvention du Plan Nacional de I+D (SAF2017-84776-R).


Fonctions critiques des CE dans l'inflammation COVID-19

Réponses inflammatoires médiées par les récepteurs immunitaires innés dans les CE

Les fonctions EC peuvent être considérées sous deux aspects dans l'immunologie de l'homéostasie et de la pathologie vasculaires. Premièrement, les CE sont une partie constitutive et intégrale du système vasculaire, et donc provoquent intrinsèquement des maladies vasculaires une fois qu'elles sont dysfonctionnelles. Deuxièmement, les CE interviennent activement dans les réponses inflammatoires ou immunitaires au niveau des sites d'infection ou de lésion. 21,22 L'immunité innée sert de première ligne de défense contre les agents pathogènes microbiens. Il dépend d'un nombre limité de protéines fonctionnelles ou de récepteurs de reconnaissance de formes (PRR), tels que les récepteurs de type Toll (TLR), les récepteurs de type NOD (nucléotide-binding oligomerization domain) (NLR) ou le gène I inductible par l'acide rétinoïque ( récepteurs de type RIG-I) (RLR). 37 L'inflammation est généralement déclenchée lorsque les PRR détectent des lésions tissulaires ou une infection microbienne. 37,38 À ce jour, notre connaissance des réponses immunitaires innées spécifiques au SRAS-CoV-2 dans les CE reste inconnue. Cependant, les interactions virus-hôte impliquant le SRAS-CoV-2 sont susceptibles de récapituler bon nombre de celles impliquant d'autres types de virus ou des infections microbiennes étant donné les mécanismes conservés de l'immunité innée. La détection par PRR de l'ARN simple brin (ARNss) et de l'ARN double brin (ARNdb) viraux, appelés modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP), et une activation supplémentaire de la réponse immunitaire innée antivirale ont été observées au cours de l'infection par le SRAS-CoV. 39,40 Les modulateurs pharmacologiques existants des réponses inflammatoires médiées par les PRR sont répertoriés dans le tableau 1.

6 et TLR9 ont été détectés dans tous les types de CE spécifiques aux tissus. 41,42 Poly (I:C), un analogue d'ARNdb synthétique, peut activer directement TLR1/2, TLR3 et TLR4. 41 Lors de l'activation par TLR, la signalisation du facteur nucléaire kappa-B (NF-κB) et de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) est initiée passant par le facteur de différenciation myéloïde 88 (MyD88) et/ou l'interféron-β inducteur d'adaptateur contenant le domaine TIR (TRIF). 41 Ce processus provoque une réponse hyper-inflammatoire en favorisant la production d'interleukine (IL)-6, d'IL-8, de facteur de nécrose tumorale (TNF)-α et d'IL-1β, et de molécules d'adhésion (E-sélectine, P-sélectine , ICAM et VCAM). Par conséquent, la perméabilité vasculaire est élevée par la rupture de la protéine de jonction claudine-5 et l'induction de facteurs procoagulants, tels que les facteurs tissulaires, l'inhibiteur de l'activateur du plasminogène de type 1 (PAI-1), le facteur von Willebrand (vWF) et l'activateur du plasminogène urokinase (uPa ). 42 Bien que TLR7/8 ne soit pas détecté dans les CE, les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) expriment TLR3. 43 EC produisent également des interférons de type I, tels que l'IFN-α. L'IFN-α est bien connu comme une cytokine importante pendant les réponses antivirales. 43 De plus, TLR9 dans les CE peut être activé lorsque les DAMP, tels que l'ADN et les protéines libérées à l'extérieur de la cellule à la suite d'une lésion tissulaire, sont reconnus. 44 Une fois activée, une phosphorylation rapide de NF-κB et des molécules d'adhésion E-sélectine et une signalisation MAPK indépendante d'ICAM-1 est détectée. 44 De plus, l'inflammation pulmonaire liée au sepsis semble dépendre de l'activation de la séquestration des neutrophiles endothéliaux régulant le TLR4 dans les poumons. 45 Collectivement, les TLR dans les CE ne sont pas seulement importants dans la défense de l'hôte contre les infections, mais ils contribuent également au dysfonctionnement microvasculaire et à l'inflammation lors d'infections systémiques.

Les protéines NOD NOD1 et NOD2 sont deux membres de la famille NLR, qui fonctionnent comme des PRR cytoplasmiques. 41 Différents types de CE, tels que les HUVEC, les CE microvasculaires et les cellules endothéliales aortiques humaines, expriment NOD1. 41,46 Lors de la stimulation microbienne, il a été démontré que les CE produisent de l'IL-8 de manière dépendante de NOD1. 46,47 Les protéines NLR contenant un PYD (NLRP) sont classées comme un autre sous-groupe NLR. Les NLRP interagissent avec l'ASC et la caspase-1, formant des complexes multiprotéiques appelés inflammasomes. 48 Les inflammasomes (par exemple, NLRP1 et NLRP3) régulent le traitement protéolytique de proIL-1β et proIL-18 en formes matures, et une mort cellulaire inflammatoire appelée pyroptose. 41 L'expression de NLRP1/3, ASC et caspase-1 a été confirmée dans les CE pulmonaires et vasculaires. 49,50 La voie NLRP3 a récemment été considérée comme une nouvelle cible pour le traitement du COVID-19. 51

RIG-I et le gène 5 associé à la différenciation du mélanome (MDA5) sont deux capteurs cytoplasmiques importants pour l'ARN viral, qui appartiennent à la famille des RLR du PRR. 37,41,42 RIG-I et MDA5 ont été détectés EC (par exemple, HUVECs), et l'expression de RIG-I est régulée à la hausse lors de la stimulation microbienne. 37,41 La protéine de signalisation antivirale mitochondriale (MAVS) de la molécule adaptatrice contenant CARD est engagée à la fois par RIG-I et MDA5, qui à leur tour stimulent les voies de signalisation résultant en une réponse IFN-α/β dépendante d'IRF3/7 et NF- Transcription des gènes inflammatoires B-dépendants. 37

CE dans les réponses immunitaires adaptatives

Des complexes d'histocompatibilité peptide-majeur (CMH) et des molécules de costimulation sont généralement requis pour l'activation des lymphocytes T. 52 Tous les vaisseaux sanguins sont tapissés de CE formant une barrière entre les cellules immunitaires sanguines et les tissus parenchymateux, et l'interaction entre les cellules T et les CE résidant dans les organes est restée pour la plupart insaisissable. Fait intéressant, une étude récente utilisant la transcriptomique unicellulaire a révélé que des niveaux élevés de gènes liés à la présentation de l'antigène médiée par le CMH de classe II ont été détectés dans un sous-type de CE capillaires pulmonaires, 53 suggérant un rôle potentiel en tant que cellules présentatrices d'antigène (APC) pour fonctionner. dans la surveillance immunitaire contre les agents pathogènes respiratoires pour ce sous-type de CE. Cependant, étant donné le manque de molécules de costimulation CD80/CD86 à la surface cellulaire, les CE ne sont pas capables d'activer les cellules T naïves. Ainsi, ils fonctionnent probablement comme des APC semi-professionnels. 54 Lorsqu'elles sont réactivées par l'IFN-γ (principalement dérivé des cellules Th1) pour exprimer les molécules du CMH, les CE stimulent efficacement la production de cytokines et la prolifération des cellules T mémoire CD4/8. 55 Il a été rapporté que les CE microvasculaires pouvaient stimuler la migration transendothéliale des cellules T CD4 à mémoire effectrice. 23 De plus, les CE des tissus chroniquement enflammés peuvent fonctionner dans la polarisation des réponses inflammatoires liées à l'immunité adaptative. 23 Une suractivation des cellules T, caractérisée par un nombre accru de cellules Th17 et une hyperactivation des cellules T CD8, avait été détectée dans le sang périphérique des infections par COVID-19. 56 Pris ensemble, les preuves ci-dessus indiquent que l'interaction des CE avec les cellules T peut conduire à une inflammation excessive dans les infections graves par COVID-19.

Recrutement leucocytaire dépendant de la molécule d'adhésion endothéliale

Les CE veinulaires forment le site principal du trafic de leucocytes du sang circulant vers les tissus. Les CE sont supposées participer au recrutement des leucocytes de la circulation sanguine vers les sites d'infection et d'inflammation. 23 Au cours du processus d'infection par le SRAS-CoV-2, les cytokines inflammatoires de l'IL-1 et du TNF-α dérivées de leucocytes activés se lient aux domaines extracellulaires du récepteur IL-1 1 (IL-1R1) et du récepteur TNF 1 (TNFR1) à la surface de la membrane endothéliale, initiant en outre diverses cascades de kinases et conduisant à l'activation de NF-κB et de la protéine activatrice 1 (AP-1). 23 Ces facteurs de transcription induisent des molécules d'adhésion (ICAM-1, VCAM-1, E-sélectine et P-sélectine). VCAM-1 a été défini à l'origine comme un ligand endothélial indépendant de CD11-/CD18 pour les leucocytes mononucléaires. 23 Il reconnaît les intégrines α4β1 et α4β7 des leucocytes. VCAM-1 est récemment apparue comme une molécule d'adhésion inductible inductible par EC qui médie le recrutement de monocytes sur les sites de blessure et d'infection. 23 ICAM-1, exprimée à la surface de l'endothélium et dans le système vasculaire périphérique, est régulée positivement dans les lésions. En se liant aux intégrines β2 des leucocytes (CD11/CD18), ICAM-1 favorise l'arrêt des leucocytes et une adhésion ferme et médie la transmigration des monocytes et des lymphocytes. 23 Les neutrophiles et les cellules T, en particulier les cellules T régulatrices (Treg) dans le sang périphérique de l'homme, possèdent des ligands de sélectine E et sont donc recrutés. 23,57 La sélectine P est une molécule d'adhésion, et principalement exprimée sur les plaquettes et l'endothélium, favorisant le roulement, l'adhésion et la transmigration des leucocytes en se liant à une glycoprotéine homodimère de type mucine à liaison disulfure, la P-sélectine glycoprotéine ligand-1 (PSGL -1) exprimé par les leucocytes. 58 La P-sélectine joue un rôle important dans les interactions leucocytes-endothéliales, en particulier dans la modulation des voies inflammatoires et la défense contre les infections. 58 Comme mentionné précédemment, les niveaux sériques de molécules d'adhésion (ICAM-1, VCAM-1, E-sélectine et P-sélectine) dans les infections graves avec COVID-19 sont considérablement augmentés. 25,59 La biopsie d'autopsie de poumons infectés par le SRAS-CoV-2 présente une agrégation mononucléaire et polymorphonucléaire, accompagnée des CE apoptotiques. 60 Nous supposons que ces molécules d'adhésion exprimées par les CE interviennent dans l'infiltration cellulaire inflammatoire et que les lésions des CE causées par les leucocytes contribuent à l'inflammation, en particulier dans les capillaires pendant la progression de COVID-19. Les modulateurs pharmacologiques existants qui agissent directement ou indirectement sur le recrutement des leucocytes par activation endothéliale sont répertoriés dans le tableau 2.


ACE2 et molécules associées dans le muscle squelettique du SRA

Voie ACE2-Ang 1-7 comme système de contre-régulation du SRA

Figure 1 ACE2, localisée sur le chromosome Xp22, est transcrite en une peptidase membranaire intégrale de type I avec 40 % d'identité et 61 % de similarité avec l'ECA [6]. Une analyse structurale récente a révélé que l'ACE2 forme un homodimère, au moins en présence du transporteur d'acides aminés B0AT1, pour lequel ACE2 fonctionne comme une protéine chaperon [7]. Contrairement à l'ACE, qui fonctionne comme une peptidyl-dipeptidase, l'ectodomaine de l'ACE2 clive l'angiotensine II [1-8] (Ang II) en Ang 1-7 en tant que monocarboxypeptidase. L'ACE2 humaine clive également l'angiotensine I en angiotensine 1-9 avec une efficacité catalytique inférieure à celle de l'Ang II en Ang 1-7, cependant, l'effet est absent chez les souris ACE2 [6,8]. En 2003, Santos et al. ont démontré que la liaison de l'Ang 1-7 aux reins était abolie chez les souris déficientes en Mas, un récepteur couplé à la protéine G qui avait été autrefois considéré comme un proto-oncogène, et a identifié Mas comme un récepteur fonctionnel de l'Ang 1-7 [9 ]. Alors que l'activité biologique de l'Ang 1-7 a été rapportée au cours des années 1980 [10-12], l'identification de l'enzyme primaire et du récepteur pour produire et lier le peptide, respectivement, a incité des études à clarifier le rôle de l'Ang 1-7 dans conditions pathologiques et physiologiques [2,13]. Ang 1-7 médie plusieurs voies de signalisation intracellulaire, y compris la synthèse d'oxyde nitrique principalement via la voie AKT-eNOS, l'inhibition de la signalisation MAP kinase (ERK1/2, p38 et JNK), l'inhibition de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) par NADPH oxydases, inhibition de la signalisation TGF-β-SMAD et modulation de la réponse de signalisation de l'AMPc [13-17]. Ces voies de signalisation exercent les actions vasodilatatrices, antiprolifératives, anti-inflammatoires et antifibrotiques de l'Ang 1-7 [13-17]. Alors qu'il a été démontré que l'Ang 1-7 exerce son effet en se liant à Mas dans plusieurs études utilisant la délétion génétique de Mas ou d'antagonistes spécifiques de Mas (c'est-à-dire A779) [13,15,16,18-20], il existe plusieurs autres récepteurs qui pourraient se lier à Ang 1-7 et exercer des réponses cellulaires et organiques pertinentes sur le plan biologique, y compris MrgD, un membre des récepteurs couplés à la protéine G liés au Mas [21,22] et des récepteurs Ang II de type2 [17,23,24]. L'Ang 1-7 se lie également aux récepteurs de l'Ang II de type 1 (AT1) et fonctionne comme un agoniste biaisé de l'AT1 [25,26]. De plus, il a été récemment rapporté que l'alamandine (Ala–Arg–Val–Tyr–Ile–His–Pro–Phe), un peptide endogène qui diffère de l'Ang 1-7 (Asp–Arg–Val–Tyr–Ile–His –Pro–Phe) dans un acide aminé N-terminal et est clivée de l'angiotensine A par ACE2, se lie à MrGD et provoque une réponse d'organe protecteur similaire à Ang 1-7 [27-30]. À ce jour, aucune étude n'a été rapportée sur la fonction de l'alamandine dans le muscle squelettique. Alors que l'ACE2 est un déterminant majeur dans la régulation du niveau tissulaire d'Ang 1-7, la néprilysine, une protéine membranaire intégrale de type II qui clive l'angiotensine I en Ang 1-7 participe également à la régulation des niveaux tissulaire et plasmatique d'Ang 1- 7 [30–32]. La néprilysine clive également l'Ang 1-7 en petits peptides ainsi que l'ECA [33,34], et l'angiotensine 1-2, le produit protéolytique de la néprylisine, s'est avérée pertinente dans la sécrétion pancréatique d'insuline [35]. Collectivement, alors que l'axe ACE2-Ang 1-7-Mas représente une voie majeure pour contrer l'activation de l'axe ACE-Ang II-AT1, les récents développements de la recherche ont révélé de multiples voies alternatives et élargi de manière diverse le réseau de régulation du RAS [ 30].

Cascades du RAS et de l'ACE2

*Produit avec décarboxylation enzymatique de l'Ang II. Abréviation : Ang I, angiotensine I.

*Produit avec décarboxylation enzymatique de l'Ang II. Abréviation : Ang I, angiotensine I.

En ce qui concerne l'activité spécifique d'organe de l'ACE2, l'élimination de l'ectodomaine de l'ACE2 par une désintégrine et une métalloprotéinase 17 (ADAM17), également connue sous le nom d'enzyme de conversion du TNFα (TACE), est une réaction biologique importante qui dégrade l'activité tissulaire de l'ACE2 dans de multiples conditions pathologiques. 36-39]. L'activité d'ADAM17 augmente en réponse à divers stimuli inflammatoires [40,41], et il a été démontré que l'ACE2 soluble circulant produit par l'excrétion avec ADAM17 est un biomarqueur potentiel des maladies cardiovasculaires humaines, y compris l'insuffisance cardiaque [42-44], la fibrillation auriculaire [45], maladie rénale chronique [46], athérosclérose [47], infarctus du myocarde [48] et accident vasculaire cérébral [49]. Petel et al. ont rapporté que l'Ang II augmente l'activité myocardique d'ADAM17, alors que les niveaux et l'activité de la protéine ACE2 myocardique sont considérablement diminués avec une augmentation correspondante de l'activité ACE2 plasmatique [37]. De plus, il a été rapporté que le muscle squelettique ADAM17 augmente dans plusieurs conditions, y compris l'augmentation de l'adiposité [50] et le diabète de type 2 [51], et qu'un agoniste PPARγ réduit l'activité musculaire ADAM17 [52] cependant, la relation entre ADAM17 et ACE2 dans le muscle squelettique n'a pas encore été étudiée. De plus, aucune étude sur l'altération des taux circulants d'ACE2 chez les patients souffrant de troubles musculaires n'est actuellement disponible.

ACE2-Ang 1-7 dans le muscle squelettique

Le muscle squelettique est un acteur central dans la régulation non seulement du système moteur mais aussi de l'homéostasie métabolique en modulant la sensibilité à l'insuline [53,54]. Activation de la voie RAS classique : il a été prouvé que l'axe ACE-Ang II-AT1 participe à la pathogenèse musculaire pour favoriser des troubles du système moteur ou de la sensibilité à l'insuline, c'est-à-dire une fonte musculaire accompagnée d'un remodelage musculaire pathologique [55-57] ou résistance à l'insuline [58,59], respectivement. Concernant la voie ACE2-Ang 1-7 en tant que système de contre-régulation de l'axe ACE-Ang II-AT1, des études antérieures dans le muscle squelettique se sont principalement concentrées sur le rôle protecteur de l'Ang 1-7 dans le remodelage musculaire pathologique et la résistance à l'insuline, et les preuves directes liant l'ECA2 à ces pathologies sont relativement faibles. Le rôle de l'Ang 1-7 dans les troubles musculaires a été largement examiné précédemment [13,60-63]. Dans cette section, nous présentons brièvement une preuve vitale à l'appui du rôle protecteur de l'Ang 1-7 dans les troubles musculaires et discutons du rôle plausible de l'ACE2 dans le RAS musculaire dans le cadre des preuves disponibles.

Remodelage musculaire

Figure 2 L'atrophie musculaire est une morbidité causée par de multiples facteurs, y compris ceux extérieurs au muscle squelettique, tels que des troubles des motoneurones, une nutrition anormale, une inflammation systémique, une immobilité physique et une insuffisance d'apport en oxygène [64]. Ici, nous discutons uniquement des pathologies qui pourraient directement provoquer un remodelage musculaire, conduisant à une fonte musculaire. Le remodelage musculaire pathologique implique deux altérations principales du muscle squelettique, notamment l'atrophie et la fibrose, qui pourraient survenir indépendamment mais de manière synergique, moduler la progression des troubles fonctionnels dans de multiples conditions pathologiques avec atrophie musculaire. Le processus de remodelage musculaire pourrait également impliquer un dysfonctionnement endothélial dans la microcirculation musculaire, et l'influence du SRA sur le dysfonctionnement endothélial dans le muscle squelettique est examinée dans la section suivante. Comme indiqué précédemment, l'activation de la voie RAS classique joue un rôle central dans le développement du remodelage musculaire pathologique en favorisant l'atrophie et la fibrose du muscle squelettique [60,63]. En bref, l'atrophie musculaire est causée par un déséquilibre dans la synthèse et la dégradation des protéines. L'Ang II altère la synthèse des protéines musculaires principalement en inhibant la voie IGF-1-AKT-mTOR. La dégradation des protéines est également favorisée par l'Ang II via l'induction de plusieurs voies de signalisation cellulaire, y compris la régulation à la hausse des atrogènes, tels que l'atrogin-1 et MuRF-1, qui induisent la dégradation des protéines dépendantes de l'ubiquitine-protéasome et l'apoptose myonucléaire dépendante des caspases. 60,63]. Ce déséquilibre de la synthèse et de la dégradation des protéines causé par l'Ang II est principalement attribué à la production de ROS dépendantes de NOX2 et à des phénomènes cellulaires ultérieurs, notamment une inflammation dépendante de NfκB et des dommages mitochondriaux [60,63].

L'axe ACE2-Ang 1-7-Mas contre-régulant l'action de l'axe ACE-Ang II-AT1 dans le développement du remodelage musculaire pathologique

La fibrose musculaire peut survenir lorsque les fibres musculaires endommagées ou atrophiées sont remplacées par des tissus conjonctifs, et l'Ang II joue un rôle central dans la promotion de la fibrose musculaire [60,63]. La production de ROS dépendante de NOX2 est également une voie de signalisation en amont de la fibrose induite par l'Ang II, et les facteurs de croissance du tissu conjonctif induits par le TGF‐β et le TGF‐β sont considérés comme des acteurs clés dans ce processus [60, 63, 65]. De plus, le processus de fibrose induite par l'Ang II pourrait impliquer une inflammation tissulaire induite par le NfκB et la capacité de régénération altérée des cellules progénitrices musculaires et des cellules satellites, alors qu'il existe une controverse en raison d'études concurrentes sur l'effet de l'Ang II sur la régénération musculaire [60, 66,67].

La compréhension actuelle de l'effet bénéfique de l'Ang 1-7 sur le remodelage musculaire s'explique principalement par l'inhibition du phénomène associé à l'Ang II pour induire l'atrophie et la fibrose. Le rôle biologique de la signalisation de l'Ang 1-7 via Mas a été suggéré par une étude qui a montré que les conditions pathologiques induisant le remodelage musculaire, y compris l'immobilisation et la perfusion d'Ang II et de LPS, augmentaient l'expression de Mas musculaire [68]. En accord avec cela, nous avons trouvé que le muscle Mas était 3,7 fois régulée à la hausse chez des souris hypertendues Tsukuba âgées de 15 mois porteuses de rénine et d'angiotensinogène humains, suggérant que Mas pourrait augmenter en compensation de la surcharge chronique d'Ang II [4]. La perfusion d'Ang 1-7 a atténué le dysfonctionnement musculaire dans de multiples pathologies, y compris la perfusion d'Ang II [69–71], la dystrophie musculaire [72,73], l'atrophie induite par la désuétude [74,75], la maladie hépatique chronique [76], la natation exhaustive l'exercice [77] et la cachexie cancéreuse [78] chez les rongeurs. La plupart de ces études ont utilisé une délétion génétique [72,75] ou une inhibition pharmacologique [69–72] de Mas pour montrer la dépendance de Mas dans les effets induits par Ang 1-7 sur le remodelage musculaire pathologique, tandis que Murphy et al. ont utilisé des souris de surexpression de Mas spécifiques au muscle ou un agoniste de Mas pour montrer les effets protecteurs de Mas dans la fonte musculaire induite par le cancer [78].

Contrairement aux multiples sources de données pour Ang 1-7 et Mas, une seule étude portant sur le rôle potentiel de l'ACE2 dans le remodelage musculaire pathologique existe actuellement [79]. Dans cette étude, Riquelme et al. ont rapporté que l'activité de l'ACE2 et les niveaux de protéines dans le muscle squelettique étaient augmentés par l'induction génétique de la dystrophie musculaire ou des blessures chroniques avec BaCl local2 injection. Cela pourrait impliquer un mécanisme de compensation pour réguler à la hausse la voie protectrice du SRA contre les lésions musculaires, ainsi qu'une augmentation de Mas dans plusieurs pathologies musculaires [4,68]. Ils ont également montré que l'injection musculaire d'adénovirus codant pour l'ACE2 humain diminuait les niveaux de collagène I et l'infiltration de macrophages dans les muscles affectés, suggérant que l'augmentation de la production d'Ang 1-7 par la surexpression de l'ACE2 contribue à la réduction de la pathologie dans la dystrophie musculaire [79]. Néanmoins, la pertinence biologique de l'ACE2 endogène dans le remodelage musculaire reste à déterminer, car on ne sait toujours pas si le niveau d'Ang 1-7 tissulaire potentiellement produit par l'ACE2 endogène est suffisant pour contribuer à la protection contre le développement d'un remodelage musculaire pathologique. De plus, Acuna et al. ont rapporté que la suppression génétique ou l'antagoniste A779 de Mas détériorait l'architecture musculaire et augmentait la fibrose et la signalisation du TGF-β avec une diminution de la force musculaire chez les souris MDX dystrophiques, suggérant que le Mas endogène dans le muscle squelettique est pertinent pour la protection contre le remodelage musculaire pathologique [72]. Cependant, étant donné la voie alternative de production d'Ang 1-7 par la néprilysine [30–32], il reste indéterminé si le rôle proposé de Mas endogène dans le remodelage musculaire est complètement lié à l'activité catalytique de l'ACE2. Des études utilisant des animaux déficients en fonction ACE2 peuvent être utiles pour tirer des conclusions sur ce sujet.

Résistance à l'insuline musculaire

Figure 3 L'accumulation de preuves a suggéré que la résistance à l'insuline dans le muscle squelettique causée par l'activation de la voie RAS classique implique principalement deux mécanismes indépendants : un trouble hémodynamique dans l'administration locale d'insuline et de glucose au muscle squelettique et une dérégulation de la signalisation cellulaire à médiation par l'insuline pour le captation du glucose dans le muscle squelettique [58–60]. Le premier est associé à un apport sanguin réduit potentiellement causé par une vasoconstriction médiée par l'Ang II et un dysfonctionnement endothélial de la microcirculation musculaire. La dysfonction endothéliale médiée par l'Ang II implique de multiples voies de signalisation, conduisant éventuellement à une diminution de la production de peroxyde nitrique [80-82]. Ce dernier est une translocation réduite du transporteur cytoplasmique du glucose 4 (GLUT4) vers la membrane plasmique en réponse à la liaison de l'insuline aux récepteurs de l'insuline dans les cellules musculaires squelettiques. Ce processus est principalement causé par les ROS générés par l'activation induite par l'Ang II du muscle NOX2 [83] qui interfère avec les cascades de signalisation intracellulaire de l'insuline, y compris le substrat du récepteur de l'insuline, la phosphatidylinositol-3-kinase, les kinases 3-phosphoinositide-dépendantes et l'AKT [58–60]. Des études antérieures ont indiqué que l'Ang 1-7 antagonise ces mécanismes cellulaires de l'Ang II dans la médiation de la résistance à l'insuline principalement par l'intermédiaire d'un récepteur, Mas. Premièrement, plusieurs sources de données ont confirmé que l'Ang 1-7 pouvait restaurer la dysfonction endothéliale dans divers organes en contrecarrant l'altération de la production de NO induite par l'Ang II [84-91]. L'implication de Mas dans la protection endothéliale induite par Ang 1-7 a été démontrée par un dysfonctionnement endothélial chez des rongeurs présentant un blocage génétique [92-94] ou pharmacologique de Mas [95]. Fait intéressant, il a été récemment rapporté que l'angiogenèse du muscle squelettique et la formation de tubes de cellules endothéliales étaient induites par Ang 1-7 et inhibées soit par la suppression génétique d'AT1a, soit par le blocage pharmacologique de Mas chez les rats Dahl sensibles au sel [96], corroborant une conclusion précédente selon laquelle l'interaction entre AT1 et Mas est essentielle dans le rôle de l'Ang 1-7 dans la fonction endothéliale [97]. De manière cohérente, il a également été démontré que la production potentielle d'Ang 1-7 par ACE2 contribue à la protection endothéliale. La surexpression ou l'activation pharmacologique de l'ACE2 améliore la fonction endothéliale dans les artères systémiques [98-100] et pulmonaires [101]. Néanmoins, il n'y a aucune preuve directe soutenant que les rôles protecteurs potentiels de l'ACE2, de l'Ang 1-7 et du Mas dans la sensibilité à l'insuline soient vraiment attribués à l'amélioration de la microcirculation dans le muscle squelettique. L'action directe de l'Ang 1-7 principalement via Mas dans la translocation médiée par l'insuline de GLUT4 a également été démontrée par plusieurs éléments de preuve dans le tissu adipeux [102,103], le cœur [104], le foie [103] et le muscle squelettique [103,105,106]. Plus récemment, il a été rapporté que l'effet insulino-sensibilisant de l'exercice était aboli par l'agoniste sélectif Mas A779 dans le muscle squelettique, suggérant que l'Ang 1-7, agissant via Mas, participe à l'amélioration de la sensibilité à l'insuline induite par l'exercice [107]. En ce qui concerne l'association de l'ACE2 au métabolisme du glucose musculaire, nous avons précédemment constaté qu'un déficit en ACE2 exagérait la résistance à l'insuline et la tolérance au glucose en réponse à un régime riche en graisses et à une perfusion d'Ang II [108].


Les auteurs tiennent à remercier le professeur Ran Friedman du Département de chimie et des sciences biomédicales, Université Linnaeus, Kalmar, Suède, pour ses commentaires perspicaces.

ACE2, enzyme de conversion de l'angiotensine 2 AP-2α, protéine de liaison activatrice de l'amplificateur 2 alpha C/EBPβ, CCAAT/protéine de liaison de l'amplificateur bêta COVID-19, maladie du coronavirus 2019 GCF, facteur de liaison à l'ADN à séquence riche GIT, tractus gastro-intestinal GR-α, récepteur des glucocorticoïdes alpha NF-AT1, facteur nucléaire des cellules T activées PAX5, boîte appariée 5 RXR-α, récepteur alpha SNP du rétinoïde X, polymorphisme mononucléotidique TFBS, site de liaison du facteur de transcription TMPRSS2, protéase transmembranaire, sérine 2 VDR, récepteur de vitamine D XBP-1, protéine de liaison X-box 1.


L'amiodarone modifie les endosomes tardifs et inhibe l'infection par le coronavirus du SRAS à un niveau post-endosomal

L'amiodarone interfère avec la voie endocytaire, inhibe la protéolyse et provoque la formation de vacuoles, mais l'absorption et la distribution intracellulaire du médicament, l'origine des vacuoles et les conséquences fonctionnelles de l'accumulation d'amiodarone restent floues. Notre objectif était d'étudier la captation de l'amiodarone, de clarifier l'origine des vacuoles et d'étudier l'effet de l'amiodarone sur le cycle de vie du coronavirus responsable du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), qui, pour pénétrer dans les cellules, repose sur le clivage protéolytique de une protéine de pointe virale par la protéinase endosomale cathepsine L. À l'aide de macrophages alvéolaires, nous avons étudié l'absorption de 125 I-amiodarone et 125 I-B2, un analogue dépourvu du groupe latéral diéthylamino-β-éthoxy, et analysé les effets de l'amiodarone sur la distribution des marqueurs endosomaux et sur l'absorption d'un colorant acidotrope. De plus, à l'aide de cellules Vero, nous avons testé l'impact de l'amiodarone sur la in vitro propagation du coronavirus du SRAS. Nous avons trouvé que (1) l'amiodarone s'associe à différentes membranes cellulaires et s'accumule dans les organites acides (2) le groupe diéthylamino-β-éthoxy est un déterminant important de l'absorption (3) les vacuoles qui se forment lors de l'exposition à l'amiodarone sont des endosomes tardifs agrandis (4) l'amiodarone inhibe la propagation in vitro du coronavirus du SRAS et (5) le clivage par la trypsine de la protéine de pointe virale avant l'infection, qui permet l'entrée du virus à travers la membrane plasmique, n'altère pas l'activité antivirale de l'amiodarone. Nous concluons que l'amiodarone altère les compartiments tardifs de la voie endocytaire et inhibe l'infection par le coronavirus du SRAS en agissant après le transit du virus à travers les endosomes.

Cet article montre que les vacuoles sont des endosomes tardifs hypertrophiés et que l'amiodarone inhibe in vitro infection à coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère agissant après la livraison du génome viral dans le cytoplasme.

Une conséquence particulière de l'administration d'amiodarone est la formation de vacuoles, de corps d'inclusion multilamellaires et de dépôts de type cristallin dans différents types cellulaires. Cependant, l'origine de ces structures est également inconnue (3, 6).

Pour clarifier certains de ces points, en utilisant des macrophages alvéolaires, nous avons analysé l'absorption et la distribution intracellulaire de 125 I-amiodarone et 125 I-B2, un analogue dépourvu du groupe diéthylamino-β-éthoxy (7). De plus, en utilisant la microscopie confocale, nous avons analysé les effets de l'amiodarone sur la distribution des marqueurs des endosomes précoces et tardifs et sur l'absorption d'un colorant acidotrope. Enfin, l'infection de cellules cibles par le coronavirus (CoV) responsable du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) reposant sur le clivage endosomal d'une protéine de surface virale, nous avons également étudié l'impact de l'amiodarone sur la in vitro propagation de cet agent infectieux nouvellement émergent (8).

Le SRAS-CoV est un virus enveloppé, avec un génome à ARN à brin positif, présentant des protubérances en forme de massue faites par les trimères de la protéine de pointe (S). La première étape du cycle de vie viral est la liaison de la protéine S à son récepteur, l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2). Par la suite, le virus est absorbé par endocytose médiée par le récepteur, se terminant dans un compartiment endosomal acide où la protéine S est clivée protéolytiquement par la protéase endosomale cathepsine L. La protéine S déclenche alors le mélange des membranes virales et endosomales, provoquant la libération du virus. génome dans le cytoplasme (9-16). Ayant découvert que l'amiodarone perturbe les compartiments tardifs de la voie endocytaire, nous avons testé son impact sur le cycle de vie du SRAS-CoV.

Les anticorps provenaient de Stressgen Biotechnologies, Eugene, OR (Rab4 et Fas) Ancell, Bayport, MN (CD63), Abcam, Cambridge, Royaume-Uni (EEA1) et Athens Research and Technology, Athènes, CA (cathepsine L).

L'amiodarone provenait de Sigma (St. Louis, MO). Le B2 (2-butyl-3-(3',5'-diiodo-4-hydroxy)-benzofurane) a été synthétisé comme indiqué (7).

La 125 I-amiodarone (activité spécifique 34,7 Ci/mmol) et la 125 I-B2 (3,36 Ci/mmol) ont été préparées selon la méthode de Bellen et collaborateurs (17).

La solubilité dans l'eau et l'interaction avec les membranes d'amiodarone et de B2 ont été mesurées comme indiqué (18, 19).

Des cellules Vero (ATCC CCL-81) ont été maintenues dans GlutaMAX I (Gibco, Carlsbad, CA), 1 % de pénicilline-streptomycine, 5 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (HyClone, Logan, UT). Les macrophages alvéolaires, obtenus après approbation institutionnelle et consentement écrit des lobes pulmonaires réséqués pour cancer du poumon, ont été conservés dans Ringer Buffered 0.1% Albumin (RBA) (4).

Macrophages, exposés pendant 60 minutes au milieu ou à 2,0 M d'oxyde de phénylarsine, 2,5 mM de chlorhydrate d'amantadine, 1,5 M de filipine, 10 M de cytochalasine D, 0,1 M de wortmannine, 0,1 M de bafilomycine A1, ou 0,1 M de concanamycine A (tous de chez Sigma), ont été incubés pendant 0 à 90 minutes avec 0,2 M de 125 I-amiodarone ou de 125 I-B2 avant de mesurer la radioactivité cellulaire. Dans certaines expériences, des fractions du surnageant postnucléaire (4, 20) ont été testées pour la radioactivité, la protéine (21), l'arylsulfatase (22), Rab4, CD63 et Fas (par Western blot).

Les macrophages exposés à 0 à 10 M d'amiodarone pendant 24 heures ont été fixés, perméabilisés, incubés avec des anticorps anti-EEA1 et anti-CD63, exposés à des anticorps secondaires conjugués alexa 488– ou alexa 546 (Molecular Probes Europe BV, Leiden, Pays-Bas) , et analysé par microscopie confocale à balayage laser (Zeiss LSM510 Zeiss, Milan, Italie) (23).

Les macrophages, incubés avec 0 à 10 M d'amiodarone pendant 24 heures, ont été exposés pendant 30 minutes à 1 mol/L de LysoSensor Green DND-189 (Molecular Probes) (24). Des images confocales ont ensuite été obtenues (Nikon Eclipse TE300 Nikon, Tokyo, Japon), et la fluorescence émise a été mesurée (Till Photonics, Martinsried, Allemagne).

Les macrophages ont été exposés pendant 24 heures à 0 ou 10 M d'amiodarone, avant d'analyser la cathepsine L dans les lysats cellulaires par Western blot (25).

Des monocouches de cellules Vero dans des plaques de culture tissulaire à 24 puits, prétraitées avec 0 à 50 M d'amiodarone pendant 2 heures, ont été infectées par le SRAS-CoV à une multiplicité d'infection (m.o.i.) de 1 pendant 1 heure à 37°C. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS et incubées pendant la nuit en présence d'amiodarone. Le virus libéré dans le surnageant a été titré sur cellules Vero et TCID50 calculé selon Spaerman-Kaerber.

Les cellules Vero ont été traitées pendant 1 heure à 37°C avec du milieu, 40 mM NH4Cl, ou avec de l'amiodarone (10 ou 50 M). Le SARS-CoV a ensuite été ajouté pendant 1 heure à 4°C (m.o.i. de 1). Après élimination de l'inoculum, les cellules ont été lavées deux fois avec du MEM sans FCS avant d'être traitées pendant 5 minutes à température ambiante avec de la trypsine traitée par L-1-tosylamido-2-phényléthyl chlorométhyl cétone (10 µg/ml Sigma). Après élimination de la trypsine, les cellules ont été incubées pendant la nuit dans un milieu de croissance, NH4Cl, ou amiodarone, et les titres viraux dans le surnageant ont été déterminés (13-15).

Les données sont des moyennes ± SEM ou des moyennes ± 95 % d'intervalle de confiance (IC). Les différences ont été analysées avec des paires t test, test de Dunnet ou test de Dunn. P < 0,05 a été jugé significatif.

L'amiodarone était plus soluble dans l'eau que la B2, en particulier à pH acide. En effet, lorsque le pH a été abaissé de 7,4 à 5,0, la solubilité dans l'eau de l'amiodarone a augmenté de 0,069 ± 0,005 à 2,04 ± 0,11 M, tandis que celle de B2 est passée de 0,009 ± 0,0001 à 0,10 ± 0,01 M (différences entre l'amiodarone et B2 et entre pH5,0 et 7,4, tous statistiquement significatifs). L'affinité de l'amiodarone pour les membranes, exprimée en logkJE SUIS, était significativement supérieure à celle de B2 à pH 7,4 (respectivement 4,23 ± 0,02 versus 3,20 ± 0,04), mais inférieure à celle de B2 à pH 5,0 (3,63 ± 0,04 versus 4,57 ± 0,08).

Récemment Bergstrom et ses collaborateurs ont rapporté que la solubilité dans l'eau de l'amiodarone augmente de 5 ordres de grandeur lorsque le pH est abaissé de 7,4 à 5,0 (18). La raison de la divergence avec nos résultats n'est pas claire. Cela pourrait être dû au fait que nous avons commencé avec 4 M d'amiodarone dans du méthanol (la concentration la plus élevée possible), tandis que Bergstrom et ses collègues ont commencé avec un excès de médicament solide.

À l'exception de la microscopie confocale, toutes les études sur les macrophages alvéolaires humains présentées dans ce travail ont déjà été réalisées sur des macrophages alvéolaires de lapin. Nous n'avons trouvé aucune différence entre les espèces compte tenu des éléments suivants : (1) Prise de 125 I-amiodarone et distribution parmi les organites du surnageant postnucléaire (2) effets de l'amiodarone sur la morphologie cellulaire au niveau EM (3) effet de l'amiodarone sur l'absorption de Lysosensor (4) effet de l'amiodarone sur la viabilité cellulaire. Ainsi, nous sommes raisonnablement sûrs que les effets observés sur les macrophages alvéolaires humains n'étaient pas liés à leur origine à partir de poumons réséqués arborant une néoplasie dans des sections différentes de celles soumises à un lavage broncho-alvéolaire.

Comme le montre la figure 1A, l'amiodarone s'est associée rapidement aux macrophages alvéolaires. La liaison/absorption était linéaire dans le temps et dépendait de manière critique de la présence du groupe diéthylamino-β-éthoxy, puisque 125 I-B2, qui manque de ce groupe, est associé aux macrophages 50 fois plus lentement que l'amiodarone (figure 1).

Figure 1. Liaison/absorption de 125 I-amiodarone et 125 I-B2 par les macrophages alvéolaires humains. (UNE) Les cellules adhérentes (10 6 ) ont été incubées avec 0,2 M de 125 I-amiodarone ou 125 I-B2 et la radioactivité associée aux cellules a été mesurée aux temps indiqués. M ± SE, m = 4. Différent de B2 : *P < 0.03, **P < 0.01 (apparié t test). (B) Effet des inhibiteurs sur la liaison/absorption de l'amiodarone par les macrophages alvéolaires. Cellules exposées pendant 60 minutes à un milieu ordinaire (témoins) ou à 2,5 mM de chlorhydrate d'amantadine (Amant), 2,0 M d'oxyde de phénylarsine (Phen), 1,5 M de filipine, 10 M de cytochalasine D (Cyt), 0,1 M de wortmannine (Wort), 0,1 M bafilomycine A1 (Bafilom), ou 0,1 M de concanamycine A (Concan), ont été incubés pendant 60 minutes avec 0,2 M de 125 I-amiodarone avant de mesurer la radioactivité associée aux cellules (m = 3–6). Absorption des cellules témoins = 100 %. *Différent de tous les autres sauf la bafilomycine ou la concanamycine, P < 0,05 par ANOVA.

L'endocytose médiée par la clathrine, les cavéoles, le transfert vectoriel de matériaux par la voie endocytique, l'endocytose en phase fluide ou le cytosquelette peuvent être inhibés ou perturbés sans changement dans l'absorption nette d'amiodarone. En effet, l'oxyde de phénylarsine et l'amantadine (inhibiteurs de l'endocytose médiée par la clathrine), la filipine (inhibiteur de l'endocytose par cavéoles), la cytochalasine D (un désassembleur du cytosquelette) et la wortmannine (qui inhibe l'endocytose en phase fluide, la phagocytose et le mouvement vectoriel des matériaux par la voie endocytaire) n'a pas influencé l'association de 125 I-amiodarone avec les macrophages (figure 1B). De l'autre côté, la bafilomycine A1 et la concanamycine A, qui dissipent l'acidité vacuolaire en inhibant la V-ATPase, a diminué l'absorption sans l'abolir (figure 1B). Étant donné que les inhibiteurs utilisés n'ont eu aucun effet néfaste sur la viabilité cellulaire, ces résultats suggèrent qu'il n'y a pas de mécanisme préférentiel d'absorption de l'amiodarone et que l'amiodarone, en plus de s'accumuler dans les organites acides, s'associe également à d'autres structures cellulaires. En fait, dans une série d'expériences dans lesquelles nous avons incubé des macrophages avec de la 125 I-amiodarone pendant 0, 30, 60 et 120 minutes, puis soumis le surnageant postnucléaire à une série de centrifugations différentielles d'une durée chacune de 10 minutes (3 000 × g, 6,000 × g, 10,000 × g, 20,000 × g, 100,000 × g), l'amiodarone s'est accumulée dans toutes les pastilles. La majeure partie de la radioactivité (plus de 85 % du total) était associée aux 3 000 × g, 6,000 × g, et 10 000 × g pellets, tandis que les 100 000 × g le surnageant contenait à tout moment moins de 2 % de la radioactivité totale (non représenté), indiquant que l'iode libre représentait une fraction mineure de la radioactivité totale.

Pour clarifier le devenir de l'amiodarone après absorption, nous avons incubé des macrophages alvéolaires avec 0,2 M de 125 I-amiodarone puis suivi la distribution de la radioactivité parmi les organites isolés du surnageant post-nucléaire. Dans le système que nous avons utilisé, les lysosomes migrent vers le fond du tube, les endosomes précoces et tardifs restent dans le tiers supérieur, les fragments de la membrane plasmique restent au sommet et les mitochondries se rassemblent tout en bas du gradient, comme déduit de la distribution de marqueurs spécifiques : arylsulfatase (lysosomes), Rab4 (endosomes précoces), CD63 (endosomes tardifs), Fas (membrane plasmique) ( ​​Figure 2 ) (23). La cytochrome C oxydase (marqueur des mitochondries) se concentre dans les fractions 1 à 4, tandis que EEA1 (un autre marqueur des endosomes précoces) a la même distribution que Rab4 (non illustré).

Figure 2. Association de l'amiodarone aux organites du surnageant postnucléaire. Les macrophages alvéolaires humains adhérents (5 × 10 6 cellules) ont été exposés à 0,2 M de 125 I-amiodarone ± 0,5 M de bafilomycine A1 pour les heures indiquées. Le surnageant postnucléaire a ensuite été fractionné par centrifugation en gradient de densité et sur les fractions la radioactivité a été comptée (Haut) la présence de Fas, Rab 4 et CD63 a été analysée par Western blot (milieu) et l'activité arylsulfatase a été mesurée (bas). La figure est représentative de trois expériences. Diamants, 30 minutes carrés, 60 minutes Triangles, 120 minutes cercles, 120 minutes + Bafilomycine.

Comme le montre la figure 2, lorsque les macrophages ont été incubés avec 0,2 M de 125 I-amiodarone, la radioactivité s'est progressivement accumulée en organites migrant aux extrémités du gradient, se collectant davantage vers le bas. Le traitement à la bafilomycine a diminué de façon marquée la radioactivité associée aux deux populations d'organites (figure 2). Ainsi, il apparaît que l'amiodarone, présentée aux cellules à de faibles concentrations, s'associe de manière dépendante du temps avec divers organites du surnageant postnucléaire, dont certains peuvent être identifiés comme des endosomes et des lysosomes sur la base de la sédimentabilité, de la distribution des marqueurs et de la sensibilité. au traitement par la bafilomycine A1.

Ces résultats ont été obtenus à partir de macrophages incubés avec 0,2 M d'amiodarone, alors que les patients sont chroniquement exposés à des concentrations allant de 1 à 4 M. Pour tester l'effet de concentrations plus élevées d'amiodarone, nous avons incubé des macrophages alvéolaires pendant 16 heures à la fois avec 0,2 et avec 10,0 M de 125 I-amiodarone, puis nous avons analysé la distribution de la radioactivité parmi les organites du surnageant postnucléaire. Comme le montre la figure 3, la concentration d'amiodarone a eu des effets marqués sur la distribution de la radioactivité. En effet, lorsqu'elle est présente à faible concentration, l'amiodarone se distribue majoritairement vers le bas du gradient, suggérant une accumulation préférentielle dans les lysosomes. À des concentrations élevées, l'amiodarone s'est accumulée principalement vers le haut du gradient, suggérant une accumulation préférentielle dans les endosomes.

Figure 3. Effet de différentes concentrations d'amiodarone sur la distribution du médicament parmi les organites du surnageant postnucléaire. Les macrophages alvéolaires humains adhérents (5 × 10 6 ) ont été incubés avec 0,2 (diamants) ou 10.2 (carrés) M 125 I-amiodarone pendant 16 heures. Le surnageant postnucléaire a ensuite été fractionné par centrifugation en gradient de densité comme indiqué sur la figure 2, et la distribution de la radioactivité à travers le gradient a été analysée. M ± SE (m = 3). Différent du contrôle, *P < 0,02 (apparié t test).

Le 125 I-B2 a été absorbé par les macrophages alvéolaires à un degré si faible que la radioactivité du surnageant postnucléaire était à peine supérieure au bruit de fond (non illustré).

Pour caractériser les vésicules se formant lors de l'exposition à l'amiodarone, nous avons analysé les effets du médicament sur la distribution des marqueurs couramment utilisés pour identifier les endosomes précoces et tardifs, respectivement EEA1 et CD63. Comme le montre la figure 4, dans les cellules de contrôle, EEA1 a décoré une population d'organites ronds, principalement situés à une extrémité de la cellule, tandis que CD63 était associé à des structures se présentant à la fois comme des points et comme un filet ténu dispersé dans tout le cytoplasme, un modèle compatible avec la morphologie tubulo-vésiculaire connue présentée par les endosomes tardifs dans les macrophages (26). Peu d'organites étaient positifs pour les deux marqueurs (figure 4). L'amiodarone n'a pas influencé la distribution de l'EEA1, mais a considérablement modifié la distribution du CD63, qui était principalement situé au bord de grandes vacuoles placées à la périphérie de la cellule (Figure 4). Comme dans les cellules témoins, très peu d'organites étaient positifs pour les deux marqueurs. Ainsi, l'amiodarone ne perturbe pas l'apparition et la distribution des endosomes précoces, mais a des effets marqués sur l'organisation des endosomes tardifs.

Figure 4. Les vacuoles induites par l'amiodarone sont des endosomes tardifs agrandis. Les macrophages alvéolaires humains ont été incubés pendant 16 heures avec du milieu ordinaire (témoins) ou avec 10 M d'amiodarone. Les cellules ont ensuite été perméabilisées et colorées par immunofluorescence indirecte en utilisant des anticorps anti EEA1 comme marqueur endosomal précoce et des anticorps anti CD63 comme marqueur endosomal tardif. Les images confocales sont affichées avec EEA1 apparaissant vert et CD63 apparaissant rouge. Des structures colocalisées apparaissent jaune dans l'image fusionnée.

L'amiodarone modifie radicalement la distribution du Lysosensor Green DND-189, un colorant acidotrope qui s'accumule dans les organites acides à la suite de la protonation et dont l'intensité de fluorescence est proportionnelle à l'acidité (24). En fait, les macrophages témoins ont accumulé Lysosensor sous forme de petites vésicules regroupées près du noyau et présentaient également une coloration diffuse du cytoplasme, tandis que les macrophages traités avec 10 M d'amiodarone ont accumulé Lysosensor dans de grandes vacuoles situées principalement à la périphérie cellulaire (Figure 5A). En plus de changer la distribution du Lysosensor DND-189, l'amiodarone a diminué l'absorption nette de la sonde, comme indiqué par la diminution de la fluorescence émise par les cellules entières (figure 5B). L'effet était dose-dépendant et significatif à 2 M d'amiodarone. L'absorption inférieure de Lysosensor en présence d'amiodarone semble avoir été due à une absorption réduite plutôt qu'à une libération accrue de la sonde, puisque les cellules chargées avec Lysosensor puis exposées à l'amiodarone ont perdu leur fluorescence plus lentement que les cellules chargées avec Lysosensor puis exposées au milieu ordinaire (non illustré).

Figure 5. Effet de l'amiodarone sur l'absorption et la distribution du Lysosensor Green DND-189 par les macrophages alvéolaires. Des cellules (10 6 ) incubées pendant 16 heures avec du milieu (témoins) ou de l'amiodarone aux concentrations indiquées ont été exposées pendant 30 minutes à 1 mol/L de LysoSensor Green DND-189. Après lavage, des images confocales ont été obtenues (UNE) et la fluorescence émise par des cellules individuelles à 505 nm en réponse à une lumière d'excitation de 440 nm a été mesurée (B). Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes dans lesquelles la fluorescence émise par 20 cellules a été mesurée. *Différent du contrôle, P < 0,05 # différent du contrôle et 2 M d'amiodarone, P < 0.01 par ANOVA.

Comme le montre la figure 6, l'amiodarone à 10 M n'a pas modifié la quantité totale de cathépsine L présente dans les lysats obtenus à partir de macrophages alvéolaires et n'a pas affecté la maturation de cette enzyme, puisque le rapport entre la procathepsine L immature (38 kD), la la forme intermédiaire de 30 kD et la cathepsine L mature (24, 25 kD) sont restées inchangées (25).

Figure 6. L'amiodarone n'affecte pas le contenu cellulaire total ni la maturation de la cathepsine L. Les macrophages alvéolaires (2 × 10 6 cellules) ont été incubés pendant 24 heures avec du milieu (témoins) ou avec 10 M d'amiodarone. Les lysats cellulaires (20 µg de protéine) ont ensuite été fractionnés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, transférés sur nitrocellulose et sondés avec un antisérum anti-cathepsine L. Bandes sont la pro-cathepsine L (38 kD), une forme intermédiaire (30 kD) et la cathepsine L mature (deux bandes de 24 et 25 kD non résolues dans les conditions utilisées). Représentant de quatre expériences.

Il a déjà été montré que l'amiodarone inhibe la dégradation de la protéine tensioactive A, entraînant l'accumulation de la protéine non clivée dans un compartiment endosomal (4). Étant donné que l'infection des cellules cibles par le SRAS-CoV dépend du clivage protéolytique de la protéine S par la cystéine protéinase lysosomale cathepsine L (13, 14), nous avons exploré la possibilité d'un effet de l'amiodarone sur le cycle de vie du SRAS. -CoV. Tout le travail avec le SRAS-CoV vivant a été effectué dans une installation de niveau de biosécurité 3 à Novartis Vaccines, à Sienne, en Italie. Des expériences préliminaires ont montré que l'amiodarone est captée par les cellules Vero, la captation étant comparable à celle des macrophages alvéolaires compte tenu de la cinétique et de la sensibilité aux inhibiteurs.

Les cellules Vero ont été incubées pendant 2 heures avec 0 à 50 M d'amiodarone puis ont été infectées par le SARS-CoV (m.o.i. de 1). Une heure après l'infection, les cellules ont été lavées et encore incubées dans un milieu de croissance en présence du médicament. Le lendemain, le surnageant de culture cellulaire a été récolté et le virus a été quantifié par titrage. Comme le montre la figure 7A, qui présente les résultats de quatre expériences indépendantes, l'amiodarone a affecté le cycle de vie du SRAS-CoV d'une manière dépendante de la concentration : 5 M d'amiodarone ont induit une diminution significative du titre de virus 10 M d'amiodarone ont diminué le titre de virus 10 fois 50 M d'amiodarone ont amené le titre de virus en dessous de la limite de détection, qui était de 10 TCID50/ml dans ce dosage.

Figure 7. Effet de l'amiodarone sur l'infection par le SRAS-CoV. (UNE) Cellules Vero incubées pendant 2 heures avec 0 à 50 M d'amiodarone, exposées pendant 1 heure au SARS-CoV (1 m.o.i.) et incubées à nouveau avec de l'amiodarone pendant 24 heures. Concentration de virus dans le surnageant évaluée par titrage en cellules Vero. Ligne pointillée = limite inférieure de détection. Représentant de quatre expériences. * Significativement différent de la concentration plus faible en amiodarone (P < 0.05). (B) Effet de NH4Cl ou amiodarone sur l'infectivité du coronavirus du SRAS traité à la trypsine. Les cellules ont été incubées à 37°C pendant 2 heures avec du milieu (contrôle), 40 mM NH4Cl, ou amiodarone (10 ou 50 M). Ensuite, les cellules ont été incubées pendant 1 heure à 4 °C avec le SRAS-CoV (1 moi/cellule), puis le virus lié aux cellules a été incubé pendant 5 minutes à 25 °C avec ou sans L-1-tosylamido-2-phényléthyl chlorométhyl cétone -trypsine traitée. Ensuite, les cellules ont été incubées à 37°C pendant 24 heures avec du DMSO (contrôles), 40 mM de NH4Cl, ou amiodarone (10 ou 50 M), et le titre viral a été déterminé dans le surnageant. Représentant de deux expériences. *Significativement différent de tous les autres (P < 0.05). Dans les deux panels, les valeurs sont des moyennes ± intervalle de confiance à 95 % (Spearman-Karber).

L'amiodarone peut être toxique pour les cellules (4, 7) et son activité antivirale pourrait être due à une diminution de la viabilité cellulaire. Pour exclure cela, les cellules Vero ont été incubées pendant 24 heures avec 0 à 50 µM d'amiodarone puis leur capacité à incorporer de l'iodure de propidium a été analysée à l'aide d'un FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Nous avons constaté que la viabilité cellulaire était supérieure à 97 % jusqu'à 30 M d'amiodarone, 91 % à 40 M d'amiodarone et 83 % à 50 M d'amiodarone. Ainsi, l'amiodarone a une activité antivirale à des concentrations auxquelles elle n'a aucun effet sur la viabilité.

L'effet antiviral de l'amiodarone pourrait être dû à un effet direct du médicament sur le SRAS-CoV. Pour clarifier ce point, le SARS-CoV dans un milieu de croissance a été incubé à 37°C pendant 24 heures sans ou avec 10 M d'amiodarone. Avant titrage sur cellules Vero, les deux mélanges ont été dilués 10 fois, de sorte que la concentration en amiodarone a diminué à 1 M (ce qui n'a aucun effet sur la propagation du SARS-CoV). Nous n'avons trouvé aucune différence significative dans le titre viral entre les deux dépôts (données non présentées). Dans une autre expérience, le SARS-CoV a été incubé à 37°C pendant 24 heures avec 5 ou 50 M d'amiodarone. Ensuite, le mélange amiodarone-virus 50 M a été dilué avec du milieu frais à 5 M et les deux mélanges ont été titrés sur des cellules Vero. Nous n'avons trouvé aucune différence significative dans le titre viral entre les deux dépôts (données non présentées). Nous concluons donc qu'une interaction directe de l'amiodarone avec le SRAS-CoV est peu probable ou non significative.

Le SRAS-CoV pénètre dans les cellules cibles en se liant via la protéine S au récepteur de surface ACE2. Le virus est alors capté pour aboutir dans un compartiment endosomal acide où, après protéolyse par la cathepsine L, la protéine S déclenche la libération du génome viral dans le cytoplasme. Un environnement de pH légèrement acide dans l'endosome semble être important, car l'infection peut être bloquée par des agents lysosomotropes comme NH4Cl ou chloroquine (13). En principe, l'amidarone pourrait diminuer l'infectiosité du SRAS-CoV en diminuant la densité des récepteurs de surface, en interférant avec l'acidification des organites ou en interférant avec la synthèse, la maturation ou l'activité de la cathepsine L. Ces mécanismes, cependant, sont peu probables. En effet, l'amiodarone ne modifie pas la densité des récepteurs ACE2 à la surface cellulaire, telle que déterminée par cytométrie en flux utilisant un anticorps monoclonal humain contre l'ACE2 (non représenté), n'inhibe pas l'acidification des organites (Réf. 4 et Figure 5) et ne interférer avec la synthèse et la maturation de la cathepsine L (figure 6).

Dans une dernière expérience, nous avons testé si l'amiodarone interfère avec les premiers stades du cycle de vie du virus, en particulier ceux impliquant les endosomes, où le médicament semble être actif. Nous avons pensé que si les endosomes étaient le seul site d'interférence de l'amiodarone avec le cycle de vie du virus, il serait alors possible de restaurer l'infectivité du virus par un traitement à la trypsine du SRAS-CoV lié aux cellules cibles (ce qui permet au virus de fusionner directement avec le membrane plasmique et d'infecter les cellules sans utiliser la voie endosomale). En conséquence, les cellules Vero ont été pré-incubées avec de l'amiodarone, puis le virus a été autorisé à se lier aux cellules à 4°C. Ensuite, de la trypsine a été ajoutée pour permettre la fusion du virus et des membranes cellulaires et la libération directe du génome du virus dans le cytosol (15). Ensuite, les cellules ont été incubées dans un milieu de croissance pendant une nuit et le titre de virus a été déterminé. Comme le montre la figure 7B, le traitement à la trypsine du virus lié aux cellules pourrait surmonter le bloc d'infection médié par le chlorure d'ammonium, le contrôle dans cette expérience, mais pas le bloc induit par l'amiodarone, ce qui indique fortement que l'amiodarone interfère avec le cycle de vie du SRAS-CoV après livraison du génome viral dans le cytosol.

L'association de l'amiodarone avec les cellules est fortement influencée par le groupe latéral diéthylamino-β-éthoxy. En fait, à pH 7,4, l'amiodarone avait une plus grande solubilité dans l'eau et une plus grande affinité pour les membranes que B2, tandis qu'à pH 5,0 l'amiodarone avait une plus grande solubilité dans l'eau mais une plus faible affinité pour les membranes que B2, indiquant que le groupe diéthylamino-β-éthoxy peut favoriser à la fois le transfert du médicament des protéines porteuses à la membrane plasmique et l'accumulation dans les organites acides. Il est clair, cependant, que l'association avec des organites acides n'est qu'une des façons dont l'amiodarone s'accumule à l'intérieur des cellules, puisque la dissipation de l'acidité vacuolaire diminue mais n'abolit pas l'absorption.

À partir des preuves actuelles, nous proposons que l'amiodarone pourrait s'associer à la membrane plasmique puis se distribuer dans différents compartiments cellulaires selon la section de la membrane plasmique dans laquelle elle se trouve. L'amiodarone se terminant dans les endosomes précoces suivra le destin de ces organites le long de la voie endocytaire et, à mesure que le pH de la lumière baisse, elle pourrait passer de la membrane limitante à la lumière. Cette interprétation peut expliquer la distribution du médicament à toutes les membranes cellulaires, l'absence d'un mécanisme préférentiel d'absorption, l'association avec les organites acides, la diminution de l'absorption après dissipation de l'acidité vacuolaire, et l'association préférentielle avec les lysosomes (qui ont le plus faible pH interne).

Les patients traités de manière chronique par amiodarone ont des concentrations plasmatiques allant de 1 à 4 M (1). Nous avons essayé de reproduire cette condition en exposant de manière aiguë des macrophages alvéolaires à 10 M d'amiodarone, un traitement qui n'affecte pas la viabilité et induit la formation de vacuoles similaires à celles observées. in vivo (4, 7).Nous montrons maintenant que les vacuoles sont des endosomes tardifs agrandis et que les endosomes précoces conservent leur configuration habituelle, en accord avec des preuves antérieures indiquant que l'amiodarone perturbe sélectivement le compartiment tardif de la voie endocytaire (4, 7).

La biogenèse et le bon fonctionnement des compartiments tardifs de la voie endocytaire dépendent d'un ensemble de protéines hautement conservées (Hrs, ESCRT I-III, Alix) qui s'assemblent du côté cytoplasmique des endosomes précoces et les font mûrir en endosomes tardifs/corps multivésiculaires (27 , 28). Récemment, il a été découvert que la suppression de hVps34, qui convertit le phosphatidylinositol en phosphatidylinositol 3-phosphate (le site d'amarrage pour SCRTIII), génère des changements similaires, bien que non identiques, à ceux induits par l'amiodarone (29). Ces changements comprennent l'épargne des endosomes précoces, la formation d'endosomes tardifs agrandis, une altération de la protéolyse endo-lysosomale et des perturbations subtiles de la maturation de la cathepsine D (29). Ainsi, étant donné que l'ESCRT III est impliquée dans la formation de corps multivésiculaires (27, 28), il est tentant de spéculer que l'amiodarone pourrait agir sur une cible apparentée et que des endosomes tardifs élargis pourraient provenir de la diminution de la formation de vésicules intraluminales.

Nous avons trouvé précédemment que l'incubation de macrophages alvéolaires avec 10,0 M d'amiodarone diminue la taille du compartiment lysosomal (4). Cela pourrait expliquer l'observation selon laquelle, lorsqu'elle est présentée aux macrophages à faible concentration (0,2 M), la 125 I-amiodarone se distribue principalement aux lysosomes, alors que lorsqu'elle est présentée à une concentration plus élevée (10,2 M), elle se distribue principalement aux endosomes.

Le rétrécissement du compartiment lysosomal pourrait également expliquer la diminution de l'absorption de Lysosensor par les macrophages incubés avec l'amiodarone.

De nombreux virus enveloppés pénètrent dans les cellules cibles par endocytose médiée par des récepteurs et leur matériel génétique atteint le cytoplasme après fusion des membranes virales et endosomales. Ce processus nécessite le réarrangement d'une protéine de surface virale et l'exposition d'un domaine hydrophobe, le peptide de fusion (30). Pour de nombreux virus, un tel réarrangement ne nécessite que le milieu légèrement acide d'un compartiment endosomal, mais certains virus, comme le virus Ebola et le SRAS-CoV, ont également besoin de l'activité d'une protéase endosomale (14, 31). Dans le cas du SRAS-CoV, la protéase nécessaire à l'invasion cellulaire est la protéase endosomale cathepsine L. En fait, l'infection par le SRAS-CoV peut être bloquée par des inhibiteurs de la V-ATPase, par des agents lysosomotropes comme le chlorure d'ammonium et par des inhibiteurs de la cathepsine. L (13).

Les compartiments endosomaux et leur bon fonctionnement jouent un rôle important dans le cycle de vie du SRAS-CoV donc, nous avons pensé que l'amiodarone, qui inhibe l'hydrolyse endo-lysosomale et interfère avec les compartiments tardifs de la voie endocytaire, pourrait interférer avec l'entrée du virus dans les cellules cibles . Nous avons constaté que l'amiodarone inhibe l'infectiosité du SRAS-CoV et que l'inhibition semble avoir lieu à un niveau post-endosomal, car l'amiodarone n'influence pas la densité de surface de l'ACE2, ne dissipe pas l'acidité luminale, n'altère pas la synthèse et la maturation de la cathepsine L, et ne peut pas être contrarié par le traitement du virus lié aux cellules avec de la trypsine, qui permet l'entrée du virus à travers la membrane plasmique.

Cependant, compte tenu de ses effets sur la morphologie cellulaire (4, 7), il est tentant de spéculer qu'elle pourrait interférer avec les étapes du cycle de vie du virus impliquant les membranes cellulaires. Par exemple, l'amiodarone pourrait interférer avec l'assemblage ou la fonction de compartiments cytoplasmiques en forme de flacon spécifiques au virus, bordés d'une double membrane dans laquelle un nouvel ARN viral est synthétisé (32-34). Alternativement, l'amiodarone pourrait interférer avec l'assemblage de protéines structurelles et d'ARN génomique dans de nouveaux virions ou pourrait inhiber la libération de virus descendants dans l'espace extracellulaire, car les complexes protéiques nécessaires à la biogenèse des corps multivésiculaires (les ESCRT) interviennent également dans le bourgeonnement du virus ( 27). De plus, il est toujours possible que les effets antiviraux de l'amiodarone se produisent également dans les endosomes.

En clair, la preuve d'une activité de l'amiodarone contre le SRAS-CoV est préliminaire et son applicabilité en clinique est sujette à caution, puisque les concentrations nécessaires pour obtenir un effet antiviral in vitro sont supérieurs aux taux sériques observés chez les patients traités pour des arythmies cardiaques. Nous pensons cependant que ce sujet mérite un examen plus approfondi pour plusieurs raisons. La première raison est que in vivo l'amiodarone est transformée en métabolites, qui conservent bon nombre des activités affichées par le médicament parent (7), et donc l'activité antivirale de l'amiodarone serait bien clarifiée par un test dans un modèle animal du SRAS, dans l'espoir que l'amiodarone et ses métabolites pourrait coopérer contre le virus. Une autre raison d'étudier in vivo l'activité antivirale de l'amiodarone découle de changements dans le tropisme du virus au cours de l'infection, car il a été suggéré qu'au début de l'infection, le SRAS-CoV peut pénétrer dans les cellules cibles par la voie endosomale, tandis qu'à des stades ultérieurs, l'inflammation pourrait libérer une variété de protéases qui pourrait induire l'entrée du virus à travers la membrane plasmique, provoquant une augmentation supplémentaire du taux de réplication (15). Nous émettons l'hypothèse que l'amiodarone pourrait atténuer ce mécanisme d'amplification, puisque in vitro son activité antivirale semble être indépendante du mécanisme d'entrée du virus dans les cellules cibles. Une autre raison pour effectuer des études de protection chez les animaux est que l'amiodarone pourrait être essayée en association avec des médicaments qui affectent le cycle de vie du virus par des mécanismes d'action différents (16).

Nous concluons que l'amiodarone perturbe les compartiments tardifs de la voie endocytaire et inhibe l'infection par le coronavirus du SRAS, agissant après la livraison du génome viral dans le cytosol.

Les auteurs remercient le professeur Federico Rea pour son aide dans l'isolement des macrophages alvéolaires humains.


État actuel des antiviraux et des cibles médicamenteuses du SRAS CoV-2 et d'autres coronavirus pathogènes humains

Coronaviridae est une famille virale particulière, avec un très grand génome à ARN et une apparence caractéristique, dotée d'une remarquable tendance à passer de l'animal à l'homme. Depuis le début du 21e siècle, trois coronavirus hautement transmissibles et pathogènes ont franchi la barrière des espèces et provoqué une pneumonie mortelle, provoquant de graves épidémies et provoquant des urgences de santé humaine d'une ampleur inconcevable. En effet, au cours des deux dernières décennies, deux coronavirus humains ont émergé causant de graves maladies respiratoires : le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-1) et le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV), causant plus de 10 000 cas cumulés, avec mortalité des taux de 10 % pour le SARS-CoV-1 et de 34,4 % pour le MERS-CoV. Plus récemment, le virus 2 du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est apparu en Chine et a été identifié comme l'agent étiologique de la récente épidémie de pandémie de COVID-19. Il s'est rapidement propagé à travers le monde, causant près de 22 millions de cas et 770 770 000 décès dans le monde, avec un taux de mortalité estimé à ∼ 3,6 %, posant ainsi de sérieux défis pour une prévention et un traitement adéquats et efficaces. Actuellement, à l'exception de l'analogue nucléotidique remdesivir, et malgré plusieurs efforts, il n'existe aucun traitement pharmacologique spécifique, éprouvé, capable d'induire efficacement et rapidement le confinement viral et la clairance de l'infection par le SRAS-CoV-2 ainsi qu'aucun médicament à spectre pour d'autres coronavirus pathogènes humains. Un autre facteur de confusion est le manque d'informations moléculaires concernant la tendance des coronavirus à acquérir une résistance aux médicaments, une lacune qui devrait être comblée afin d'optimiser l'efficacité des médicaments antiviraux.

Dans cette optique, la présente revue fournit une mise à jour systématique des connaissances actuelles sur les efforts mondiaux marqués pour le développement de stratégies antivirales visant à faire face à l'infection soutenue par le SRAS-CoV-2 et d'autres coronavirus pathogènes humains, affichant des profils de résistance aux médicaments. L'attention s'est portée sur les médicaments antiviraux ciblant principalement la protéase virale, l'ARN polymérase et la glycoprotéine de pointe, qui ont été testés in vitro et/ou dans des essais cliniques ainsi que sur des composés prometteurs prouvés actifs contre les coronavirus par un in silico approche de réorientation des médicaments. À cet égard, de nouvelles informations sur les composés, identifiées par un criblage virtuel basé sur la structure sur la base de données DrugBank dotée d'un profil de ciblage multiple, sont également rapportées. Nous avons spécifiquement identifié 14 composés prometteurs caractérisés par une bonne in silico affinité de liaison vers au moins deux des quatre cibles étudiées (protéines virales et hôtes). Parmi lesquels, le ceftolozane et le NADH ont montré le meilleur profil de multi-ciblage, réduisant ainsi potentiellement l'émergence de souches virales résistantes. Nous nous sommes également concentrés sur des cibles pharmacologiques potentiellement nouvelles pour le développement de composés ayant une activité anti-coronavirus. Grâce à l'analyse d'un grand nombre de séquences génomiques virales, la revue actuelle fournit une carte complète et spécifique des régions conservées à travers les protéines du coronavirus humain qui sont essentielles pour la réplication du virus et donc avec aucune ou une tendance très limitée à muter. Par conséquent, ceux-ci représentent des cibles médicamenteuses clés pour de nouveaux composés contre cette famille de virus. À cet égard, l'identification de stratégies pharmacologiques hautement efficaces et innovantes est d'une importance primordiale pour le traitement et/ou la prophylaxie de la pandémie actuelle mais potentiellement aussi pour les épidémies futures et inévitables de coronavirus pathogènes humains.


Les désinfectants aident à tuer le coronavirus&mdashmais s'il vous plaît ne les buvez pas

Désolé, apparemment il y a eu un 2ème malentendu.
Il ne voulait pas dire que sa déclaration était une blague.

Il voulait dire qu'il était une blague.

Les démocrates étaient très enthousiastes à l'idée de voter pour la première femme présidente en 2016, et ils ont quand même perdu (même s'ils ont remporté la majorité du vote populaire).

Les deux partis ont enregistré une participation record.

Je pense que tous les partisans de Trump devraient écouter et faire ce que suggère leur président.

Et pourtant, la désapprobation de Trump se situe à environ 50 %, semaine après semaine.

La moitié des Américains pensent que c'est bien.

Et pourtant, la désapprobation de Trump se situe à environ 50 %, semaine après semaine.

La moitié des Américains pensent que c'est bien.

Ne perdez pas de temps à raisonner ou à comprendre. Concentrez-vous sur les élections de novembre.

Je maintiens qu'il n'est pas stupide, mais qu'il est tellement égoïste et qu'il doit mettre son tampon sur tout ce qu'il dit au hasard juste pour s'assurer que sa voix en fait partie.

Les États-Unis sont un pays où ils doivent mettre des pictogrammes de nourrissons suffocants, car sinon les parents intenteront des poursuites après les avoir (fatalement) donnés à leurs tout-petits comme jouets.

Les États-Unis sont un pays où ils doivent mettre des panneaux « glissant lorsqu'ils sont mouillés » lorsqu'ils nettoient le sol, sinon il y aura des poursuites judiciaires de la part de personnes blessées qui n'ont en quelque sorte pas appris que les fluides réduisent le coefficient de friction.

Et pourtant, quelque chose oblige le président à prononcer des paroles qui peuvent être interprétées comme suggérant que les gens mangent des produits chimiques toxiques. Il ne peut tout simplement pas retenir les mots. Il doit ajouter quelque chose pour s'associer à la nouvelle selon laquelle l'eau de Javel tue les virus. Puisque toutes les choses vraies/utiles/éducatives ont déjà été dites par les honnêtes/utiles/informés, tout ce qui reste est. connerie.

Pas tout à fait surprenant, il existe un mot allemand pour cela : Geltungsdrang. Le besoin d'être compté/de faire partie de la conversation/d'être admiré.

Le chef de l'État en bois n'a jamais dit plus clairement qu'il était un vendeur d'huile de serpent.

J'ai vu un titre :
"N'injectez pas de désinfectants, prévient Lysol alors que Trump soulève l'idée"

Ce n'était pas une parodie. Ce n'était pas dans The Onion.

Et apparemment aussi fatigué d'un pays qui fonctionne.

A leurs yeux, c'était déjà cassé, car ils n'étaient pas en haut de la pile..

Ils ont juste besoin d'un million de dollars inconvénient brevet de vaccin et ils seront là avec Ellison, Trump et tous les autres.

Sérieusement, j'ai une question technique/scientifique à ce sujet. Et oui, s'il vous plaît, supportez-moi - je connais très peu les virii et la biologie en général (plus un gars de matériel informatique).

À première vue, cela dit qu'à 35C/80% d'humidité, le virus meurt rapidement par rapport à 24C/20% d'humidité. Cependant, naïvement, j'imagine que l'intérieur du corps ressemble beaucoup plus à 35 ° C (37,5 ° C ?) Et 80 % (100 % ?) d'humidité - alors pourquoi le virus ne meurt-il pas presque instantanément ? Est-ce qu'il commence à se reproduire *CELA* rapidement ? Comme dans 5-10 minutes ? J'ai toujours pensé que la reproduction du virus prenait quelques heures pour vraiment démarrer, mais je me trompe probablement.

"Sarcastique de jouer avec les médias."

J'espère que Trump décidera de s'injecter une capsule de plomb à haute vitesse.

J'espère en fait qu'il vivra jusqu'à un âge avancé. Privé de sa petite bulle de protection narcissique et forcé de faire face à ce qu'il est vraiment et a fait, et à l'enregistrement historique de ces choses pour toute la postérité, bien sûr.

Une mort rapide et inconsciente est loin d'être facile pour des créatures comme ça ! *

* Normalement, je ne préconise pas de punir des choses qui ne sont pas cognitivement capables d'apprendre de la punition (fouetteriez-vous un chien parce qu'il ne peut pas apprendre à parler anglais ?), mais je ferai une exception ici, comme la leçon de choses pourrait le faire profiter aux autres.

Sérieusement, j'ai une question technique/scientifique à ce sujet. Et oui, s'il vous plaît, supportez-moi - je connais très peu les virii et la biologie en général (plus un gars de matériel informatique).

À première vue, cela dit qu'à 35C/80% d'humidité, le virus meurt rapidement par rapport à 24C/20% d'humidité. Cependant, naïvement, j'imagine que l'intérieur du corps ressemble beaucoup plus à 35 ° C (37,5 ° C ?) Et 80 % (100 % ?) d'humidité - alors pourquoi le virus ne meurt-il pas presque instantanément ? Est-ce qu'il commence à se reproduire *CELA* rapidement ? Comme dans 5-10 minutes ? J'ai toujours pensé que la reproduction du virus prenait quelques heures pour vraiment démarrer, mais je me trompe probablement.

Je suppose que la température serait pour la destruction "dans l'air". Pas dans une belle solution saline à l'intérieur d'un corps vivant, où les températures et les effets seraient probablement différents en raison de l'environnement oxydant différent.

(Oups ! Que Mr Trump suggère que les gens injectent de l'air directement dans leurs veines !)

Je ne sais pas à quel point l'analyse est précise.

J'habite à Singapour et la température de la fin oscille autour de 30 à 35 degrés. C'est super humide ici - au moins au-dessus de 80 pour cent en moyenne.

Au cours du dernier mois, nous avons eu une explosion de cas principalement dans les dortoirs des travailleurs étrangers. Ces travailleurs étrangers travaillent principalement dans le secteur de la construction ou sortent les poubelles etc. le tout sous le soleil brûlant. Les dortoirs n'ont pas de climatisation et sont, comme on peut s'y attendre, très chauds.

Hé, regardez ça, il y a eu un énorme pic de popularité de la recherche sur le "25e amendement" depuis le 1er mars de cette année.

Pendant ce temps, je finalise mes plans pour le mémorial de Donald J. Trump. Je suppose que nous pouvons mettre une toilette branlante à l'arrière du Lincoln Memorial à D.C., avec le papier toilette spécial imprimé avec la Constitution des États-Unis afin que vous puissiez vous essuyer le cul avec, tout comme "The Donald".

Recherchez une page Go Fund Me qui s'ouvrira bientôt.

Les gestionnaires de l'enculé essaient maintenant de le faire tourner car "c'était sarcastique !".

Non, il faisait ses conneries habituelles, remplissant l'air de ses excrétions auditives sans se soucier de ce qui sortait réellement de sa bouche. Tout ce qu'il faisait était d'essayer de donner l'impression qu'il commandait à ses subordonnés de faire des trucs, parce que c'est le seul truc qu'il a en plus de mentir.

Le spin " était sarcastique ! " est utilisé quand ils n'ont rien de mieux à utiliser.

L'ont-ils déjà utilisé auparavant ? Habituellement, ils doublent le mensonge stupide et/ou tout simplement éhonté sur les "fausses nouvelles".

Sérieusement, j'ai une question technique/scientifique à ce sujet. Et oui, s'il vous plaît, supportez-moi - je connais très peu les virii et la biologie en général (plus un gars de matériel informatique).

À première vue, cela dit qu'à 35C/80% d'humidité, le virus meurt rapidement par rapport à 24C/20% d'humidité. Cependant, naïvement, j'imagine que l'intérieur du corps ressemble beaucoup plus à 35 ° C (37,5 ° C ?) Et 80 % (100 % ?) d'humidité - alors pourquoi le virus ne meurt-il pas presque instantanément ? Est-ce qu'il commence à se reproduire *CELA* rapidement ? Comme dans 5-10 minutes ? J'ai toujours pensé que la reproduction du virus prenait quelques heures pour vraiment démarrer, mais je me trompe probablement.

Les démocrates étaient très enthousiastes à l'idée de voter pour la première femme présidente en 2016, et ils ont quand même perdu (même s'ils ont remporté la majorité du vote populaire).

Les deux partis ont enregistré une participation record.

Tout comme un FYI, selon wikipedia
https://en.wikipedia.org/wiki/Voter_tur . _élections
2016 n'a enregistré une participation record qu'en chiffres absolus. En pourcentage de la population en âge de voter, 2016 était du côté (déprimeusement bas) des chiffres du dernier demi-siècle à 55,7 %. Mais ce n'était pas près du record. 2008 avait 58,2% (pas record non plus) et 2012 était proche de 54,9%.

Et juste parce que j'étais curieux. Il n'a d'informations que depuis 1828, mais le plus haut était de 1876 à 81,8%. Nous n'avons pas cassé 70 % depuis plus d'un siècle.

Il pourrait dire aux gens de boire Favor-Aid avec du cyanure dedans.

Les démocrates étaient très enthousiastes à l'idée de voter pour la première femme présidente en 2016, et ils ont quand même perdu (même s'ils ont remporté la majorité du vote populaire).

Les deux partis ont enregistré une participation record.

Tout comme un FYI, selon wikipedia
https://en.wikipedia.org/wiki/Voter_tur . _élections
2016 n'a enregistré une participation record qu'en chiffres absolus. En pourcentage de la population en âge de voter, 2016 était du côté (déprimeusement bas) des chiffres du dernier demi-siècle à 55,7 %. Mais ce n'était pas près du record. 2008 avait 58,2% (pas record non plus) et 2012 était proche de 54,9%.

Et juste parce que j'étais curieux. Il n'a d'informations que depuis 1828, mais le plus haut était de 1876 à 81,8%. Nous n'avons pas cassé 70 % depuis plus d'un siècle.

Je pense que personne ne réalise à quel point les choses peuvent être mauvaises. Recoller les morceaux va être difficile.

Sérieusement, j'ai une question technique/scientifique à ce sujet. Et oui, s'il vous plaît, supportez-moi - je connais très peu les virii et la biologie en général (plus un gars de matériel informatique).

À première vue, cela dit qu'à 35C/80% d'humidité, le virus meurt rapidement par rapport à 24C/20% d'humidité. Cependant, naïvement, j'imagine que l'intérieur du corps ressemble beaucoup plus à 35 ° C (37,5 ° C ?) Et 80 % (100 % ?) d'humidité - alors pourquoi le virus ne meurt-il pas presque instantanément ? Est-ce qu'il commence à se reproduire *CELA* rapidement ? Comme dans 5-10 minutes ? J'ai toujours pensé que la reproduction du virus prenait quelques heures pour vraiment démarrer, mais je me trompe probablement.

Votre nez est l'endroit où l'air est chauffé avant d'entrer dans vos poumons. Il peut faire beaucoup plus frais aux points d'entrée (nez et yeux) qu'à l'intérieur de votre corps.

Les démocrates étaient très enthousiastes à l'idée de voter pour la première femme présidente en 2016, et ils ont quand même perdu (même s'ils ont remporté la majorité du vote populaire).

Les deux partis ont enregistré une participation record.

Tout comme un FYI, selon wikipedia
https://en.wikipedia.org/wiki/Voter_tur . _élections
2016 n'a enregistré une participation record qu'en chiffres absolus. En pourcentage de la population en âge de voter, 2016 était du côté (déprimeusement bas) des chiffres du dernier demi-siècle à 55,7 %. Mais ce n'était pas près du record. 2008 avait 58,2% (pas record non plus) et 2012 était proche de 54,9%.

Et juste parce que j'étais curieux. Il n'a d'informations que depuis 1828, mais le plus haut était de 1876 à 81,8%. Nous n'avons pas cassé 70 % depuis plus d'un siècle.

Je pense que personne ne réalise à quel point les choses peuvent être mauvaises. Recoller les morceaux va être difficile.

Je crois que c'est aussi ce que les Égyptiens, les Grecs, les Romains et les Espagnols ont dit.

Si vous me le demandez, il semble que Trump essaie de tuer ses propres électeurs.

Plus j'y pense, plus c'est fou.

Ce n'est pas comme Bush II, où beaucoup de gens l'ont traité d'idiot. Je suis toujours à peu près sûr que c'est probablement un gars raisonnablement intelligent, juste un orateur de merde qui a fait des choses un peu moins intelligentes.

Je pense que Trump pourrait * en fait * être d'une intelligence inférieure à la moyenne. Je suis sûr que la plupart des gens qui ne sont pas émotionnellement impliqués dans le monde politique savent que le gars n'est pas le laser le plus brillant du spectacle de lumière, c'est clair depuis longtemps. Je ne dis pas qu'il a un handicap mental profond ou qu'il est comme trois sigma vers la gauche sur la courbe en cloche, mais… wow. Je suis juste à court de mots.

En parlant de George W Bush, l'année dernière, j'ai regardé une interview de lui parlant de son passe-temps de peinture et j'ai été frappé de voir à quel point il était plus éloquent que dans mon souvenir. C'était incroyable.

En y réfléchissant, je ne pense pas qu'il s'est amélioré en parlant, mais comparé à notre président actuel, il pourrait aussi bien être Shakespeare.

Pour moi, la chose à propos de W. était que même si je n'étais pas d'accord avec tout ce que l'homme avait dit ou fait, je croyais qu'IL croyait en la vérité de ce qu'il disait et qu'il faisait ce qu'il pensait être le mieux pour le pays. Nous étions simplement en désaccord sur les interprétations et sur ce qu'il fallait faire en réponse. Je pense qu'il est et était un homme TRÈS authentique. Et je pense que son père l'était aussi.

Donald Trump était, est et sera toujours un escroc et un escroc. Il n'est là que pour lui et sa famille.

Et ayant perdu plusieurs parents proches à cause de la démence, je crois sincèrement qu'il en montre également les premiers signes. Certaines des choses qu'il fait sont identiques à ce que ma grand-mère et mon arrière-grand-mère ont fait au fur et à mesure que leurs conditions évoluaient.

Je suis un peu déconcerté par le ton presque d'excuse que prend cet article.

Sa première suggestion était que nous « quotitions le corps » avec un énorme [quelque chose - Trump a tendance à avoir des problèmes pour terminer un train de pensées], que ce soit des UV ou simplement une lumière très puissante. Il saute sur cette idée à partir de l'information selon laquelle la lumière du soleil sur les surfaces externes dégrade rapidement Cov2. De toute évidence, cette lumière ne peut pas pénétrer dans votre corps, alors il augmente la mise en suggérant que nous pourrions obtenir de la lumière dans une personne "ce que vous pouvez faire soit à travers la peau ou d'une autre manière". "Une autre façon" signifierait à peu près insérer une lumière visible brillante ou pire une lumière UV à l'intérieur de quelqu'un.

Puis il dit "Puis je vois le désinfectant, où il l'assomme en une minute. Une minute. Et y a-t-il un moyen de faire quelque chose comme ça, par injection à l'intérieur ou presque un nettoyage ».

On pourrait dire que "faire quelque chose comme ça" suggère qu'il ne pensait pas spécifiquement à injecter du désinfectant à une personne - mais presque tout ce qui peut être qualifié de désinfectant sera aussi dangereux. et comme sa promotion bizarre de la chloroquine, les gens vont sauter par-dessus cette partie et la lire comme "Trump pense que le Lysol va guérir le covid19!"

Ce n'était pas un moment de "Trump pensant à haute voix", c'était encore un autre moment où Trump disait simplement ce qui lui passait par la tête SANS PENSER DU TOUT.

Sérieusement, j'ai une question technique/scientifique à ce sujet. Et oui, s'il vous plaît, supportez-moi - je connais très peu les virii et la biologie en général (plus un gars de matériel informatique).

À première vue, cela dit qu'à 35C/80% d'humidité, le virus meurt rapidement par rapport à 24C/20% d'humidité. Cependant, naïvement, j'imagine que l'intérieur du corps ressemble beaucoup plus à 35 ° C (37,5 ° C ?) Et 80 % (100 % ?) d'humidité - alors pourquoi le virus ne meurt-il pas presque instantanément ? Est-ce qu'il commence à se reproduire *CELA* rapidement ? Comme dans 5-10 minutes ? J'ai toujours pensé que la reproduction du virus prenait quelques heures pour vraiment démarrer, mais je me trompe probablement.

Votre nez est l'endroit où l'air est chauffé avant d'entrer dans vos poumons. Il peut faire beaucoup plus frais aux points d'entrée (nez et yeux) qu'à l'intérieur de votre corps.

Ce n'est pas non plus équivalent en ce que même avec 80% d'humidité et 35 ° C - c'est sur une surface non biologique. Une fois dans vos voies respiratoires, le virus a le temps d'entrer en contact avec la muqueuse de vos voies nasales, de votre gorge et de vos voies respiratoires et de tenter d'infecter une cellule.

Chronométrez le temps qu'il faut pour prendre une respiration modérément profonde - moins d'une seconde. Dans cette seconde, il peut voyager jusqu'au fond de vos poumons. Et ce n'est pas un virus, ce sera un nuage d'entre eux.

La raison pour laquelle SC2 est si infectieux est que les protéines de la «couronne» sont exceptionnellement bonnes pour coller aux récepteurs ACE3 de ces cellules, il n'en faut donc que quelques-unes pour déclencher une infection.

Un qui se passe, tout se passe À L'INTÉRIEUR de vos cellules de la muqueuse pulmonaire où les lumières vives ou les désinfectants ou les températures élevées ou l'humidité ne feront aucune différence. Une fois qu'ils sortiront d'une cellule, il y en aura des dizaines de milliers qui infecteront les cellules qui les entourent ou qui s'effectueront rapidement dans la toux.

J'aimerais vraiment voir le chat en vrac pour le QG d'Ars Orbiting avant cet article. Vraiment.

Tous les organes de presse devraient collectivement cesser de rendre compte de ce que Donald Trump * dit * et ne rapporter que ce qu'il * fait * réellement, car chaque article de presse parle invariablement de la stupidité choquante de ses commentaires sur * tout *, alors les gens l'ignorent.

Si Donald Trump a *fait* quelque chose de vraiment horrible, il est perdu dans le bruit blanc de ses commentaires stupides, ou oublié le lendemain lorsqu'il dit autre chose de choquant.

Cet article en est un parfait exemple : combien de personnes auraient sérieusement envisagé de s'injecter du désinfectant si personne ne savait que Trump en avait jamais parlé ?

C'est presque comme s'il savait comment les médias rendront compte de lui et agit en conséquence pour créer un maximum de chaos.

Il a fait quelque chose de vraiment horrible en suggérant que les gens s'injectent des désinfectants comme remède contre le COVID-19.

Les démocrates étaient très enthousiastes à l'idée de voter pour la première femme présidente en 2016, et ils ont quand même perdu (même s'ils ont remporté la majorité du vote populaire).

Les deux partis ont enregistré une participation record.

Tout comme un FYI, selon wikipedia
https://en.wikipedia.org/wiki/Voter_tur . _élections
2016 n'a enregistré une participation record qu'en chiffres absolus. En pourcentage de la population en âge de voter, 2016 était du côté (déprimeusement bas) des chiffres du dernier demi-siècle à 55,7 %. Mais ce n'était pas près du record. 2008 avait 58,2% (pas record non plus) et 2012 était proche de 54,9%.

Et juste parce que j'étais curieux. Il n'a d'informations que depuis 1828, mais le plus haut était de 1876 à 81,8%. Nous n'avons pas cassé 70 % depuis plus d'un siècle.

Je pense que personne ne réalise à quel point les choses peuvent être mauvaises. Recoller les morceaux va être difficile.

Je crois que c'est aussi ce que les Égyptiens, les Grecs, les Romains et les Espagnols ont dit.

Je ne parle pas seulement de cette pandémie.

Sérieusement, j'ai une question technique/scientifique à ce sujet. Et oui, s'il vous plaît, supportez-moi - je connais très peu les virii et la biologie en général (plus un gars de matériel informatique).

À première vue, cela dit qu'à 35C/80% d'humidité, le virus meurt rapidement par rapport à 24C/20% d'humidité. Cependant, naïvement, j'imagine que l'intérieur du corps ressemble beaucoup plus à 35 ° C (37,5 ° C ?) Et 80 % (100 % ?) d'humidité - alors pourquoi le virus ne meurt-il pas presque instantanément ? Est-ce qu'il commence à se reproduire *CELA* rapidement ? Comme dans 5-10 minutes ? J'ai toujours pensé que la reproduction du virus prenait quelques heures pour vraiment démarrer, mais je me trompe probablement.

Votre nez est l'endroit où l'air est chauffé avant d'entrer dans vos poumons. Il peut faire beaucoup plus frais aux points d'entrée (nez et yeux) qu'à l'intérieur de votre corps.

Ce n'est pas non plus équivalent en ce que même avec 80% d'humidité et 35 ° C - c'est sur une surface non biologique. Une fois dans vos voies respiratoires, le virus a le temps d'entrer en contact avec la muqueuse de vos voies nasales, de votre gorge et de vos voies respiratoires et de tenter d'infecter une cellule.

Chronométrez le temps qu'il faut pour prendre une respiration modérément profonde - moins d'une seconde. Dans cette seconde, il peut voyager jusqu'au fond de vos poumons. Et ce n'est pas un virus, ce sera un nuage d'entre eux.

La raison pour laquelle SC2 est si infectieux est que les protéines de la «couronne» sont exceptionnellement bonnes pour coller aux récepteurs ACE3 de ces cellules, il n'en faut donc que quelques-unes pour déclencher une infection.

Un qui se passe, tout se passe À L'INTÉRIEUR de vos cellules de la muqueuse pulmonaire où les lumières vives ou les désinfectants ou les températures élevées ou l'humidité ne feront aucune différence. Une fois qu'ils sortiront d'une cellule, il y en aura des dizaines de milliers qui infecteront les cellules qui les entourent ou qui s'effectueront rapidement dans la toux.

Sérieusement, j'ai une question technique/scientifique à ce sujet. Et oui, s'il vous plaît, supportez-moi - je connais très peu les virii et la biologie en général (plus un gars de matériel informatique).

À première vue, cela dit qu'à 35C/80% d'humidité, le virus meurt rapidement par rapport à 24C/20% d'humidité. Cependant, naïvement, j'imagine que l'intérieur du corps ressemble beaucoup plus à 35 ° C (37,5 ° C ?) Et 80 % (100 % ?) d'humidité - alors pourquoi le virus ne meurt-il pas presque instantanément ? Est-ce qu'il commence à se reproduire *CELA* rapidement ? Comme dans 5-10 minutes ? J'ai toujours pensé que la reproduction du virus prenait quelques heures pour vraiment démarrer, mais je me trompe probablement.

Votre nez est l'endroit où l'air est chauffé avant d'entrer dans vos poumons. Il peut faire beaucoup plus frais aux points d'entrée (nez et yeux) qu'à l'intérieur de votre corps.

Ce n'est pas non plus équivalent en ce que même avec 80% d'humidité et 35 ° C - c'est sur une surface non biologique. Une fois dans vos voies respiratoires, le virus a le temps d'entrer en contact avec la muqueuse de vos voies nasales, de votre gorge et de vos voies respiratoires et de tenter d'infecter une cellule.

Chronométrez le temps qu'il faut pour prendre une respiration modérément profonde - moins d'une seconde. Dans cette seconde, il peut voyager jusqu'au fond de vos poumons. Et ce n'est pas un virus, ce sera un nuage d'entre eux.

La raison pour laquelle SC2 est si infectieux est que les protéines de la «couronne» sont exceptionnellement bonnes pour coller aux récepteurs ACE3 de ces cellules, il n'en faut donc que quelques-unes pour déclencher une infection.

Un qui se passe, tout se passe À L'INTÉRIEUR de vos cellules de la muqueuse pulmonaire où les lumières vives ou les désinfectants ou les températures élevées ou l'humidité ne feront aucune différence. Une fois qu'ils sortiront d'une cellule, il y en aura des dizaines de milliers qui infecteront les cellules qui les entourent ou qui s'effectueront rapidement dans la toux.

L'une des choses intéressantes à propos de cette enzyme particulière est qu'elle n'est pas très présente à la surface des alvéoles pulmonaires, du moins par rapport à certains des organes internes. Cela signifie que le virus peut infecter ces cellules à loisir, libérant sa progéniture dans l'expiration, sans entraver sérieusement le fonctionnement des poumons. Ce n'est que lorsque l'attaque se déplace vers les aires de reproduction les plus prodigues que la tempête de cytokines commence pour de bon.


Voir la vidéo: COVID-19: coronavirus et ACE2 (Août 2022).