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E5. Médicaments de liaison à l'ADN - Biologie

E5. Médicaments de liaison à l'ADN - Biologie


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La plupart des médicaments utilisés aujourd'hui se lient à des protéines spécifiques et interfèrent avec l'activité de la protéine. Stuart Schreiber à Harvard a été un chef de file dans ce domaine.

Une autre façon d'inhiber la transcription d'un gène spécifique consiste à lier un petit ADN simple brin à l'ADNdb pour former une triple hélice. La molécule d'ADN simple brin peut se lier aux donneurs de liaison H exposés et aux accepteurs de bases non impliquées dans les interactions de liaison Watson-Crick H entre les bases complémentaires dans l'ADN db.

Figure : Triple hélice

Le brin simple se lie à de tels donneurs qui sont accessibles dans le bosquet principal d'ADNdb.

Les analogues peptide-acide nucléique, comme indiqué ci-dessous, sont de nouveaux médicaments prometteurs. Ils sont moins chargés que les acides nucléiques (ils peuvent donc plus facilement traverser une membrane) et résistent au clivage par les protéases et les nucléases. On pourrait les imaginer se liant à des séquences nucléotidiques spécifiques et inhibant des processus tels que la réplication et la transcription de l'ADN.

Les facteurs de transcription qui sont généralement activés par des événements génétiques ou des voies de signalisation en amont sont des régulateurs clés de l'état cellulaire. En raison des interfaces protéine-protéine étendues et de l'absence générale de poches hydrophobes qui pourraient inhiber les interactions protéine:protéine nécessaires à la régulation transcriptionnelle, il a été difficile de concevoir des médicaments qui se lient aux facteurs de transcription et modulent leur activité. Moellering et al. rapportent le développement réussi d'un antagoniste à action directe d'un facteur de transcription oncogène, NOTCH1. Cet antagoniste se compose de peptides -hélicoïdaux stabilisés perméables aux cellules, des SAHM qui ont été « agrafés » en une hélice stable par l'ajout de deux acides aminés alcényles non naturels qui, par la fermeture du cycle, ont restreint stériquement le peptide dans une hélice alpha. L'hélice imitait une région d'interface protéine:protéine dans le complexe ternaire d'ADN:NOTCH1:MAML1 (qui est une protéine coactivatrice). Les peptides s'opposent à la signalisation NOTCH et à la prolifération cellulaire dans les cellules de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T (T-ALL).


Collection de structures de laboratoire de liaison à l'ADN

Collection de structures de laboratoire de liaison à l'ADN

La collection de structures DNA Binding Lab est une activité de laboratoire autonome avec un ensemble de « structures inconnues » que les étudiants explorent pour en savoir plus sur la structure de l'ADN et les interactions entre l'ADN et d'autres molécules. Ce laboratoire s'adresse aussi bien aux lycéens qu'aux collégiens.

De nombreuses étapes fondamentales de la biologie commencent lorsque les protéines se lient à l'ADN. Les protéines copient l'ADN, coupent l'ADN, réparent l'ADN, utilisent l'ADN comme matrice pour fabriquer de l'ARN, enveloppent l'ADN dans des structures qui l'aident à s'intégrer dans le noyau et se lient à l'ADN pour contrôler tous ces processus. D'autres molécules, telles que les médicaments antitumoraux ou les antibiotiques, peuvent également se lier à l'ADN. Parfois, ces autres molécules bloquent des activités telles que la réplication et la transcription de l'ADN. Parfois, ils causent des problèmes et conduisent à des maladies comme le cancer.

Dans ce laboratoire de biologie numérique, les étudiants travaillent avec des structures moléculaires pour identifier les sillons majeurs et mineurs de l'ADN et voir à quoi cela ressemble lorsque des protéines ou des médicaments se lient à ces régions. Le laboratoire de liaison à l'ADN de Molecule World vous permet d'ajouter la modélisation moléculaire à votre boîte à outils de classe.

Un ensemble de structures inconnues fournit un outil d'évaluation en permettant à chaque élève d'étudier une structure différente et de déterminer si une protéine ou un médicament se lie au sillon principal, au sillon mineur ou aux deux, et de capturer une image à remettre comme preuve pour étayer sa conclusion .

*** Nous avons remplacé cette application par une collection de structures pouvant être utilisées dans Molecule World. Allez au Collection de structures de laboratoire de liaison à l'ADN pour télécharger l'ensemble des structures d'ADN et obtenir les instructions du laboratoire.


Interaction de petites molécules avec une structure G-quadruplex à cinq voies de guanine du promoteur MYC humain

Il a été largement admis que l'ADN peut adopter d'autres structures biologiquement pertinentes à côté de la double hélice Watson-Crick. Un exemple récent important est la structure guanine-quadruplex (G-quadruplex) formée par les faisceaux de guanine trouvés dans la région promotrice MYC (ou c-myc), qui régule la transcription de l'oncogène MYC. La stabilisation de ce G-quadruplex par des ligands, comme la porphyrine cationique TMPyP4, diminue le niveau transcriptionnel de MYC. Ici, nous rapportons la première structure d'un fragment d'ADN contenant cinq voies de guanine de cette région. Un pli G-quadruplex inhabituel, qui a été dérivé de contraintes RMN utilisant des approches d'attribution de résonance indépendantes du modèle sans ambiguïté, implique un noyau de trois tétrades de guanine empilées formées par quatre voies de guanine parallèles avec toutes les anti-guanines et une syn guanine à l'extrémité 3' du snapback. Nous avons déterminé la structure du complexe formé entre ce G-quadruplex et le TMPyP4. Ces informations structurelles, combinées aux détails de l'interaction des petites molécules, fournissent une plate-forme pour la conception de médicaments anticancéreux ciblant les séquences multi-guanine que l'on trouve dans le MYC et d'autres promoteurs oncogènes, ainsi que dans les télomères.

Déclaration de conflit d'intérêts

DÉCLARATION D'INTÉRÊTS CONCURRENTS

Les auteurs déclarent ne pas avoir d'intérêts financiers concurrents.

Les figures

étude RMN de la MYC…

étude RMN de la MYC promoteur de séquences riches en guanine. ( une ) Les 600…

Structure de la Pu24I quadruplex.…

Structure de la Pu24I quadruplex. ( une ) Vue stéréo de huit superposés…

Interaction entre le Pu24I quadruplex…

Interaction entre le Pu24I quadruplex et différents ligands contrôlés par RMN. (…

étude RMN de la Pu24I…

étude RMN de la Pu24I –Complexe TMPyP4. ( une ) La structure de…

Six structures raffinées superposées de…

Six structures raffinées superposées du Pu24I complexe quadruplex-TMPyP4. ( une ) Côté…


Contenu

Chez l'homme, le TP53 est situé sur le bras court du chromosome 17 (17p13.1). [8] [9] [10] [11] Le gène s'étend sur 20 kb, avec un exon 1 non codant et un premier intron très long de 10 kb. La séquence codante contient cinq régions montrant un degré élevé de conservation chez les vertébrés, principalement dans les exons 2, 5, 6, 7 et 8, mais les séquences trouvées chez les invertébrés ne présentent qu'une ressemblance éloignée avec le mammifère TP53. [15] TP53 des orthologues [16] ont été identifiés chez la plupart des mammifères pour lesquels des données génomiques complètes sont disponibles.

Gène TP53 humain Modifier

Chez l'homme, un polymorphisme courant implique la substitution d'une arginine à une proline à la position du codon 72. De nombreuses études ont étudié un lien génétique entre cette variation et la susceptibilité au cancer, mais les résultats ont été controversés. Par exemple, une méta-analyse de 2009 n'a pas réussi à montrer de lien avec le cancer du col de l'utérus. [17] Une étude de 2011 a révélé que le TP53 La mutation de la proline a eu un effet profond sur le risque de cancer du pancréas chez les hommes. [18] Une étude sur des femmes arabes a révélé que l'homozygotie de la proline à TP53 le codon 72 est associé à une diminution du risque de cancer du sein. [19] Une étude a suggéré que TP53 Les polymorphismes du codon 72, MDM2 SNP309 et A2164G peuvent collectivement être associés à une susceptibilité au cancer non oropharyngé et que MDM2 SNP309 en combinaison avec TP53 le codon 72 peut accélérer le développement d'un cancer non oropharyngé chez la femme. [20] Une étude de 2011 a révélé que TP53 Le polymorphisme du codon 72 était associé à un risque accru de cancer du poumon. [21]

Les méta-analyses de 2011 n'ont trouvé aucune association significative entre TP53 polymorphismes du codon 72 et à la fois le risque de cancer colorectal [22] et le risque de cancer de l'endomètre. [23] Une étude de 2011 d'une cohorte de naissance brésilienne a trouvé une association entre l'arginine non mutante TP53 et les personnes sans antécédents familiaux de cancer. [24] Une autre étude de 2011 a révélé que le génotype homozygote p53 (Pro/Pro) était associé à un risque significativement accru de carcinome rénal. [25]

  1. un domaine d'activation de la transcription (TAD) N-terminal acide, également connu sous le nom de domaine d'activation 1 (AD1), qui active les facteurs de transcription. L'extrémité N-terminale contient deux domaines d'activation transcriptionnelle complémentaires, un majeur aux résidus 1-42 et un mineur aux résidus 55-75, spécifiquement impliqués dans la régulation de plusieurs gènes pro-apoptotiques. [26]
  2. domaine d'activation 2 (AD2) important pour l'activité apoptotique : résidus 43-63. domaine riche important pour l'activité apoptotique de p53 par exportation nucléaire via MAPK : résidus 64-92.
  3. domaine central de liaison à l'ADN (DBD). Contient un atome de zinc et plusieurs acides aminés d'arginine : résidus 102-292. Cette région est responsable de la liaison du co-répresseur p53 LMO3. Domaine [27] (NLS), résidus 316-325.
  4. domaine d'homo-oligomérisation (DO) : résidus 307-355. La tétramérisation est essentielle pour l'activité de p53 in vivo. impliqué dans la régulation négative de la liaison à l'ADN du domaine central : résidus 356-393. [28]

Les mutations qui désactivent p53 dans le cancer se produisent généralement dans le DBD. La plupart de ces mutations détruisent la capacité de la protéine à se lier à ses séquences d'ADN cibles, et empêchent ainsi l'activation transcriptionnelle de ces gènes. En tant que telles, les mutations dans le DBD sont des mutations récessives de perte de fonction. Les molécules de p53 avec des mutations dans la DO se dimèrent avec p53 de type sauvage, et les empêchent d'activer la transcription. Par conséquent, les mutations OD ont un effet négatif dominant sur la fonction de p53.

La p53 de type sauvage est une protéine labile, comprenant des régions repliées et non structurées qui fonctionnent de manière synergique. [29]

Dommages à l'ADN et réparation Modifier

p53 joue un rôle dans la régulation ou la progression à travers le cycle cellulaire, l'apoptose et la stabilité génomique au moyen de plusieurs mécanismes :

  • Il peut activer les protéines de réparation de l'ADN lorsque l'ADN a subi des dommages. Ainsi, il peut être un facteur important du vieillissement. [30]
  • Il peut arrêter la croissance en maintenant le cycle cellulaire au point de régulation G1/S sur la reconnaissance des dommages à l'ADN - s'il maintient la cellule ici assez longtemps, les protéines de réparation de l'ADN auront le temps de réparer les dommages et la cellule pourra continuer le cycle cellulaire.
  • Il peut déclencher l'apoptose (c'est-à-dire la mort cellulaire programmée) si les dommages à l'ADN s'avèrent irréparables.
  • Il est essentiel pour la réponse de sénescence aux télomères courts.

WAF1/CIP1 codant pour p21 et des centaines d'autres gènes en aval. p21 (WAF1) se lie aux complexes G1-S/CDK (CDK4/CDK6, CDK2 et CDK1) (molécules importantes pour la transition G1/S dans le cycle cellulaire) inhibant leur activité.

Lorsque p21(WAF1) est complexé avec CDK2, la cellule ne peut pas passer à l'étape suivante de la division cellulaire. Un mutant p53 ne se liera plus à l'ADN de manière efficace et, par conséquent, la protéine p21 ne sera pas disponible pour agir en tant que « signal d'arrêt » pour la division cellulaire. [31] Les études sur les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) décrivent généralement l'axe p53-p21 non fonctionnel de la voie du point de contrôle G1/S avec une pertinence ultérieure pour la régulation du cycle cellulaire et la réponse aux dommages à l'ADN (DDR). Il est important de noter que l'ARNm de p21 est clairement présent et régulé à la hausse après le DDR dans les CSEh, mais la protéine p21 n'est pas détectable. Dans ce type cellulaire, p53 active de nombreux microARN (comme miR-302a, miR-302b, miR-302c et miR-302d) qui inhibent directement l'expression de p21 dans les CSEh.

La protéine p21 se lie directement aux complexes cycline-CDK qui font avancer le cycle cellulaire et inhibe leur activité kinase, provoquant ainsi l'arrêt du cycle cellulaire pour permettre la réparation. p21 peut également médier un arrêt de croissance associé à la différenciation et un arrêt de croissance plus permanent associé à la sénescence cellulaire. Le gène p21 contient plusieurs éléments de réponse p53 qui interviennent dans la liaison directe de la protéine p53, entraînant une activation transcriptionnelle du gène codant pour la protéine p21.

Les voies p53 et RB1 sont liées via p14ARF, ce qui soulève la possibilité que les voies puissent se réguler mutuellement. [32]

L'expression de p53 peut être stimulée par la lumière UV, qui provoque également des dommages à l'ADN. Dans ce cas, p53 peut déclencher des événements conduisant au bronzage. [33] [34]

Cellules souches Modifier

Les niveaux de p53 jouent un rôle important dans le maintien des cellules souches tout au long du développement et du reste de la vie humaine.

Dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), p53 est maintenue à de faibles niveaux inactifs. [35] En effet, l'activation de p53 conduit à une différenciation rapide des CSEh. [36] Des études ont montré que l'élimination de p53 retarde la différenciation et que l'ajout de p53 provoque une différenciation spontanée, montrant comment p53 favorise la différenciation des CSEh et joue un rôle clé dans le cycle cellulaire en tant que régulateur de différenciation. Lorsque p53 se stabilise et s'active dans les CSEh, il augmente p21 pour établir un G1 plus long. Cela conduit généralement à l'abolition de l'entrée en phase S, qui arrête le cycle cellulaire en G1, conduisant à la différenciation. Des travaux sur des cellules souches embryonnaires de souris ont cependant montré récemment que l'expression de P53 ne conduit pas nécessairement à une différenciation. [37] p53 active également miR-34a et miR-145, qui répriment ensuite les facteurs de pluripotence des CSEh, incitant davantage la différenciation. [35]

Dans les cellules souches adultes, la régulation de p53 est importante pour le maintien de la souche dans les niches de cellules souches adultes. Les signaux mécaniques tels que l'hypoxie affectent les niveaux de p53 dans ces cellules de niche par le biais des facteurs inductibles par l'hypoxie, HIF-1α et HIF-2α. Alors que HIF-1α stabilise p53, HIF-2α le supprime. [38] La suppression de p53 joue un rôle important dans le phénotype des cellules souches cancéreuses, les cellules souches pluripotentes induites et d'autres rôles et comportements de cellules souches, tels que la formation de blastème. Il a été démontré que les cellules avec des niveaux réduits de p53 se reprogramment en cellules souches avec une efficacité beaucoup plus grande que les cellules normales. [39] [40] Les articles suggèrent que l'absence d'arrêt du cycle cellulaire et d'apoptose donne à plus de cellules la chance d'être reprogrammées. Il a également été démontré que la diminution des niveaux de p53 était un aspect crucial de la formation de blastème dans les pattes des salamandres. [41] La régulation de p53 est très importante car elle agit comme une barrière entre les cellules souches et un état différencié des cellules souches, ainsi qu'une barrière entre les cellules souches fonctionnelles et cancéreuses. [42]

Autre Modifier

Outre les effets cellulaires et moléculaires ci-dessus, p53 a un effet anticancéreux au niveau tissulaire qui agit en inhibant l'angiogenèse. Au fur et à mesure que les tumeurs se développent, elles doivent recruter de nouveaux vaisseaux sanguins pour les alimenter, et p53 inhibe cela en (i) interférant avec les régulateurs de l'hypoxie tumorale qui affectent également l'angiogenèse, tels que HIF1 et HIF2, (ii) inhibant la production de facteurs favorisant l'angiogenèse, et (iii) augmenter directement la production d'inhibiteurs de l'angiogenèse, tels que l'arresten. [43] [44]

Il a été démontré que p53 en régulant le facteur inhibiteur de la leucémie facilite l'implantation chez la souris et peut-être la reproduction chez l'homme. [45]

p53 devient activé en réponse à une myriade de facteurs de stress, y compris, mais sans s'y limiter, les dommages à l'ADN (induits par les UV, les IR ou des agents chimiques tels que le peroxyde d'hydrogène), le stress oxydatif, [46] le choc osmotique, l'épuisement des ribonucléotides et l'expression oncogène dérégulée. Cette activation est marquée par deux événements majeurs. Premièrement, la demi-vie de la protéine p53 est considérablement augmentée, entraînant une accumulation rapide de p53 dans les cellules stressées. Deuxièmement, un changement de conformation force p53 à être activé en tant que régulateur de transcription dans ces cellules. L'événement critique conduisant à l'activation de p53 est la phosphorylation de son domaine N-terminal. Le domaine d'activation transcriptionnelle N-terminal contient un grand nombre de sites de phosphorylation et peut être considéré comme la cible principale des protéines kinases transduisant les signaux de stress.

Les protéines kinases qui sont connues pour cibler ce domaine d'activation transcriptionnelle de p53 peuvent être grossièrement divisées en deux groupes. Un premier groupe de protéines kinases appartient à la famille MAPK (JNK1-3, ERK1-2, p38 MAPK), qui est connue pour répondre à plusieurs types de stress, tels que les dommages membranaires, le stress oxydatif, le choc osmotique, le choc thermique, etc. Un deuxième groupe de protéines kinases (ATR, ATM, CHK1 et CHK2, DNA-PK, CAK, TP53RK) est impliqué dans le point de contrôle de l'intégrité du génome, une cascade moléculaire qui détecte et répond à plusieurs formes de dommages à l'ADN causés par le stress génotoxique. Les oncogènes stimulent également l'activation de p53, médiée par la protéine p14ARF.

Dans les cellules non stressées, les niveaux de p53 sont maintenus bas grâce à une dégradation continue de p53. Une protéine appelée Mdm2 (également appelée HDM2 chez l'homme), se lie à p53, empêchant son action et la transporte du noyau vers le cytosol. Mdm2 agit également comme une ubiquitine ligase et attache de manière covalente l'ubiquitine à p53 et marque ainsi p53 pour la dégradation par le protéasome. Cependant, l'ubiquitylation de p53 est réversible. A l'activation de p53, Mdm2 est également activé, mettant en place une boucle de retour. Les niveaux de p53 peuvent montrer des oscillations (ou des impulsions répétées) en réponse à certains stress, et ces impulsions peuvent être importantes pour déterminer si les cellules survivent au stress ou meurent. [47]

Le MI-63 se lie au MDM2, réactivant p53 dans les situations où la fonction de p53 est inhibée. [48]

Une protéase spécifique de l'ubiquitine, USP7 (ou HAUSP), peut cliver l'ubiquitine de p53, la protégeant ainsi de la dégradation dépendante du protéasome via la voie de l'ubiquitine ligase. C'est un moyen par lequel p53 est stabilisé en réponse à des agressions oncogènes. USP42 a également été montré pour désubiquitiner p53 et peut être nécessaire pour la capacité de p53 à répondre au stress. [49]

Des recherches récentes ont montré que HAUSP est principalement localisé dans le noyau, bien qu'une fraction de celui-ci puisse être trouvée dans le cytoplasme et les mitochondries. La surexpression de HAUSP entraîne une stabilisation de p53. Cependant, l'épuisement de HAUSP n'entraîne pas une diminution des niveaux de p53 mais augmente plutôt les niveaux de p53 en raison du fait que HAUSP se lie et désubiquitine Mdm2. Il a été démontré que HAUSP est un meilleur partenaire de liaison à Mdm2 que p53 dans les cellules non stressées.

Cependant, l'USP10 s'est avéré être localisé dans le cytoplasme des cellules non stressées et désubiquitine p53 cytoplasmique, inversant l'ubiquitination de Mdm2. Suite à des dommages à l'ADN, l'USP10 se déplace vers le noyau et contribue à la stabilité de p53. De plus, USP10 n'interagit pas avec Mdm2. [50]

La phosphorylation de l'extrémité N-terminale de p53 par les protéines kinases mentionnées ci-dessus perturbe la liaison à Mdm2. D'autres protéines, telles que Pin1, sont ensuite recrutées pour p53 et induisent un changement de conformation dans p53, ce qui empêche encore plus la liaison à Mdm2. La phosphorylation permet également la liaison de coactivateurs transcriptionnels, tels que p300 et PCAF, qui acétylent ensuite l'extrémité carboxy-terminale de p53, exposant le domaine de liaison à l'ADN de p53, lui permettant d'activer ou de réprimer des gènes spécifiques. Les enzymes désacétylases, telles que Sirt1 et Sirt7, peuvent désacétyler p53, entraînant une inhibition de l'apoptose. [51] Certains oncogènes peuvent également stimuler la transcription de protéines qui se lient à MDM2 et inhibent son activité.

Si la TP53 gène est endommagé, la suppression tumorale est gravement compromise. Les personnes qui héritent d'une seule copie fonctionnelle du TP53 gène développera très probablement des tumeurs au début de l'âge adulte, un trouble connu sous le nom de syndrome de Li-Fraumeni.

Les TP53 Le gène peut également être modifié par des mutagènes (produits chimiques, radiations ou virus), augmentant la probabilité d'une division cellulaire incontrôlée. Plus de 50 pour cent des tumeurs humaines contiennent une mutation ou une délétion du TP53 gène. [52] La perte de p53 crée une instabilité génomique qui se traduit le plus souvent par un phénotype d'aneuploïdie. [53]

Augmenter la quantité de p53 peut sembler une solution pour le traitement des tumeurs ou la prévention de leur propagation. Ceci, cependant, n'est pas une méthode de traitement utilisable, car elle peut provoquer un vieillissement prématuré. [54] La restauration de la fonction p53 normale endogène est prometteuse. La recherche a montré que cette restauration peut conduire à la régression de certaines cellules cancéreuses sans endommager d'autres cellules dans le processus. Les voies par lesquelles la régression tumorale se produit dépendent principalement du type de tumeur. Par exemple, la restauration de la fonction p53 endogène dans les lymphomes peut induire l'apoptose, tandis que la croissance cellulaire peut être réduite à des niveaux normaux. Ainsi, la réactivation pharmacologique de p53 se présente comme une option viable de traitement du cancer. [55] [56] La première thérapie génique commerciale, Gendicine, a été approuvée en Chine en 2003 pour le traitement du carcinome épidermoïde de la tête et du cou. Il délivre une copie fonctionnelle du gène p53 à l'aide d'un adénovirus modifié. [57]

Certains agents pathogènes peuvent également affecter la protéine p53 que le TP53 gène exprime. Un tel exemple, le virus du papillome humain (VPH), code pour une protéine, E6, qui se lie à la protéine p53 et l'inactive. Ce mécanisme, en synergie avec l'inactivation du régulateur du cycle cellulaire pRb par la protéine HPV E7, permet une division cellulaire répétée se manifestant cliniquement par des verrues. Certains types de VPH, en particulier les types 16 et 18, peuvent également conduire à une évolution d'une verrue bénigne vers une dysplasie cervicale de bas ou haut grade, qui sont des formes réversibles de lésions précancéreuses. Une infection persistante du col de l'utérus au fil des ans peut provoquer des changements irréversibles conduisant à un carcinome in situ et éventuellement à un cancer du col invasif. Ceci résulte des effets des gènes HPV, en particulier ceux codant pour E6 et E7, qui sont les deux oncoprotéines virales préférentiellement retenues et exprimées dans les cancers du col de l'utérus par intégration de l'ADN viral dans le génome de l'hôte. [58]

La protéine p53 est continuellement produite et dégradée dans les cellules de personnes en bonne santé, ce qui entraîne une oscillation amortie. La dégradation de la protéine p53 est associée à la liaison de MDM2. Dans une boucle de rétroaction négative, MDM2 lui-même est induit par la protéine p53. Les protéines p53 mutantes échouent souvent à induire le MDM2, provoquant l'accumulation de p53 à des niveaux très élevés. De plus, la protéine p53 mutante elle-même peut inhiber les niveaux normaux de protéine p53. Dans certains cas, il a été démontré que des mutations faux-sens uniques dans p53 perturbent la stabilité et la fonction de p53. [59]

Il a été démontré que la suppression de p53 dans les cellules humaines du cancer du sein entraîne une augmentation de l'expression du gène du récepteur de la chimiokine CXCR5 et une migration cellulaire activée en réponse à la chimiokine CXCL13. [60]

Une étude a révélé que les protéines p53 et Myc étaient essentielles à la survie des cellules de la leucémie myéloïde chronique (LMC). Le ciblage des protéines p53 et Myc avec des médicaments a donné des résultats positifs sur des souris atteintes de LMC. [61] [62]

La plupart des mutations de p53 sont détectées par séquençage de l'ADN. Cependant, il est connu que les mutations faux-sens simples peuvent avoir un large spectre d'affects fonctionnels plutôt légers à très sévères. [59]

Le large spectre de phénotypes cancéreux dus à des mutations dans le TP53 gène est également soutenu par le fait que différentes isoformes de protéines p53 ont des mécanismes cellulaires différents pour la prévention contre le cancer. mutations dans TP53 peut donner naissance à différentes isoformes, empêchant leur fonctionnalité globale dans différents mécanismes cellulaires et étendant ainsi le phénotype du cancer de léger à sévère. Des études récentes montrent que les isoformes de p53 sont exprimées de manière différentielle dans différents tissus humains, et que les mutations de perte de fonction ou de gain de fonction au sein des isoformes peuvent provoquer un cancer spécifique aux tissus ou fournir un potentiel de cellules souches cancéreuses dans différents tissus. [12] [63] [64] [65] La mutation TP53 affecte également le métabolisme énergétique et augmente la glycolyse dans les cellules cancéreuses du sein. [ citation requise ]

La dynamique des protéines p53, ainsi que son antagoniste Mdm2, indiquent que les niveaux de p53, en unités de concentration, oscillent en fonction du temps. Cette oscillation « amortie » est à la fois documentée cliniquement [66] et modélisée mathématiquement. [67] [68] Les modèles mathématiques indiquent également que la concentration de p53 oscille beaucoup plus rapidement une fois que les agents tératogènes, tels que les cassures double brin (DSB) ou le rayonnement UV, sont introduits dans le système. Cela soutient et modélise la compréhension actuelle de la dynamique de p53, où les dommages à l'ADN induisent l'activation de p53 (voir la régulation de p53 pour plus d'informations). Les modèles actuels peuvent également être utiles pour modéliser les mutations des isoformes p53 et leurs effets sur l'oscillation p53, favorisant ainsi de novo découverte de médicaments pharmacologiques spécifiques aux tissus.

p53 a été identifié en 1979 par Lionel Crawford, David P. Lane, Arnold Levine et Lloyd Old, travaillant à l'Imperial Cancer Research Fund (Royaume-Uni), à l'Université de Princeton/UMDNJ (Cancer Institute of New Jersey) et au Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, respectivement. Il avait été émis l'hypothèse qu'il existait auparavant en tant que cible du virus SV40, une souche qui induisait le développement de tumeurs. Les TP53 Le gène de la souris a été cloné pour la première fois par Peter Chumakov de l'Académie des sciences de l'URSS en 1982, [69] et indépendamment en 1983 par Moshe Oren en collaboration avec David Givol (Weizmann Institute of Science). [70] [71] L'humain TP53 gène a été cloné en 1984 [8] et le clone complet en 1985. [72]

Il était initialement présumé être un oncogène en raison de l'utilisation d'ADNc muté après purification de l'ARNm des cellules tumorales. Son rôle en tant que gène suppresseur de tumeur a été révélé en 1989 par Bert Vogelstein à la Johns Hopkins School of Medicine et Arnold Levine à l'Université de Princeton. [73] [74]

Warren Maltzman, de l'Institut Waksman de l'Université Rutgers, a d'abord démontré que le TP53 réagissait aux dommages à l'ADN sous forme de rayonnement ultraviolet. [75] Dans une série de publications en 1991-1992, Michael Kastan de l'Université Johns Hopkins, a rapporté que TP53 était une partie critique d'une voie de transduction de signal qui a aidé les cellules à répondre aux dommages à l'ADN. [76]

En 1993, p53 a été voté molécule de l'année par la revue Science. [77]

Comme 95% des gènes humains, TP53 code pour plus d'une protéine. Plusieurs isoformes ont été découvertes en 2005, et à ce jour 12 isoformes humaines de p53 ont été identifiées (p53α, p53β, p53γ, ∆40p53α, ∆40p53β, ∆40p53γ, ∆133p53α, ∆133p53β, ∆133p53γ, 160p53α, ∆160p53γ, ∆160p53 ). De plus, les isoformes de p53 sont exprimées de manière tissu-dépendante et p53α n'est jamais exprimé seul. [12]

Les protéines isoformes p53 pleine longueur peuvent être subdivisées en différents domaines protéiques. En partant de l'extrémité N-terminale, il y a d'abord les domaines de transactivation amino-terminaux (TAD 1, TAD 2), qui sont nécessaires pour induire un sous-ensemble de gènes cibles p53. Ce domaine est suivi du domaine riche en proline (PXXP), moyennant quoi le motif PXXP est répété (P est une proline et X peut être n'importe quel acide aminé). Il est requis entre autres pour l'apoptose médiée par p53. [78] Certaines isoformes n'ont pas le domaine riche en proline, telles que Δ133p53β,γ et Δ160p53α,β,γ. Par conséquent, certaines isoformes de p53 ne médient pas l'apoptose, soulignant les rôles diversifiants du TP53 gène. [63] Ensuite, il y a le domaine de liaison à l'ADN (DBD), qui permet aux protéines de séquencer une liaison spécifique. Le domaine carboxyle terminal complète la protéine. Il comprend le signal de localisation nucléaire (NLS), le signal d'exportation nucléaire (NES) et le domaine d'oligomérisation (OD). Le NLS et le NES sont responsables de la régulation subcellulaire de p53. Grâce à l'OD, p53 peut former un tétramère puis se lier à l'ADN. Parmi les isoformes, certains domaines peuvent être manquants, mais tous partagent la plupart du domaine de liaison à l'ADN hautement conservé.

Les isoformes sont formées par différents mécanismes. Les isoformes bêta et gamma sont générées par l'épissage multiple de l'intron 9, ce qui conduit à un C-terminal différent. De plus, l'utilisation d'un promoteur interne dans l'intron 4 provoque les isoformes 133 et 160, qui manquent du domaine TAD et d'une partie du DBD. De plus, l'initiation alternative de la traduction au codon 40 ou 160 porte les isoformes ∆40p53 et ∆160p53. [12]

En raison de la nature isoformique des protéines p53, il existe plusieurs sources de preuves montrant que des mutations dans le TP53 gènes donnant lieu à des isoformes mutées sont des agents responsables de divers phénotypes de cancer, de légers à graves, en raison d'une mutation unique dans le TP53 gène (voir la section Analyse expérimentale des mutations de p53 pour plus de détails).


Conjugués platine-intercalateur : des dérivés de cisplatine ciblés sur l'ADN aux complexes de liaison à l'adénine en tant que modulateurs potentiels de la régulation des gènes

L'ADN nucléaire est la cible cellulaire de nombreux traitements contre le cancer, et les chimiothérapies dirigées par l'ADN continuent de jouer un rôle important dans la découverte de médicaments à l'ère postgénomique. La majorité des agents anticancéreux ciblés sur l'ADN se lient par des interactions covalentes, une intercalation non covalente ou une liaison par sillon, ou des modes de liaison hybrides. La séquence et la régiospécificité de ces interactions et les altérations structurelles qui en résultent au sein du biopolymère jouent un rôle important dans le mécanisme d'action de ces médicaments. Les protéines de liaison à l'ADN et/ou les enzymes de traitement de l'ADN, qui interagissent également avec l'ADN d'une manière spécifique à la séquence et au sillon, sont des médiateurs de l'effet cytotoxique produit par ces agents. Ainsi, un objectif majeur dans la conception de nouveaux agents cliniques de ce type est de produire de nouveaux types d'adduits sur l'ADN, ce qui peut conduire à des mécanismes de destruction cellulaire sans précédent. Les conjugués platine-intercalant sont une telle classe d'agents hybrides agissant via un double mode de liaison à l'ADN. Le centre du platine (généralement une unité cis-diaminedichloroPt(II)) domine les profils d'adduit d'ADN dans la majorité de ces espèces - le résultat de la tendance du métal à former des liaisons croisées dans des séries de bases de guanine consécutives dans le sillon principal de l'ADN. Ce paradigme a été récemment rompu pour la première fois avec la conception de conjugués cytotoxiques platine-acridinylthiourée, une classe d'agents dirigés à faible sillon adénine-affinique. Cette revue résume les principaux progrès de la chimie et de la biologie des intercalateurs en platine de 1984 à 2004, en mettant l'accent sur l'interaction entre la structure chimique, le mécanisme de liaison à l'ADN et les propriétés biologiques.


Méthodes

Génération de mutants selon un ratio de mutation spécifique

Nous avons utilisé un algorithme d'algorithme génétique (AG) comme stratégie de mutation pour la génération de descendants. Dans la première génération, 10 3 séquences de gènes ont été générées aléatoirement, chaque séquence a produit 10 4 descendants avec un taux de mutation de 10 -4 . Comme les processus de modélisation structurelle et d'amarrage sont très coûteux en calcul, la taille de la population et la fréquence des mutations ont été réduites à un niveau gérable par le calcul. Dans l'algorithme GA, la taille de la population a été contrôlée en supprimant les individus les moins bien classés, n'autorisant que les 5 % supérieurs d'individus contenant des mutations. Si le numéro de séquence éligible dépassait 1000, alors les 1000 premières séquences mutantes étaient sélectionnées. Les séquences originales avec les scores les plus élevés ont été utilisées pour remplir la population si le numéro de séquence éligible était inférieur à 1000. La séquence d'ADN de chaque individu a été traduite en une séquence de protéines, qui a ensuite été soumise à une modélisation de la structure des protéines et à un amarrage moléculaire. Le score d'évaluation final d'un mutant a été calculé, selon l'Eq. (1). L'évolution génétique a été considérée comme terminée lorsque le mutant le mieux classé a donné une affinité de liaison inférieure au médicament qu'à l'ATP.

Calculs d'emballage de chaîne latérale

Nous avons utilisé le programme Scap (http://honig.c2b2.columbia.edu/scap/) pour modéliser les structures des protéines mutantes 40,41. Un script Perl a été utilisé pour appeler le module Scap, dans le but de convertir les résidus mutés en la variation correspondante de la structure de la protéine. Scap is used to build side chain conformations using its coordinate rotamer libraries. As we do not want the mutation to change the protein structure significantly, we chose an AMBER force field with a heavy atom model and a mixed side chain rotamer library. The other parameters were set to the default values, which allowed a relatively stable mutant protein conformation. We used the Scap program to generate structures of thousands of residue mutations.

Protein-drug docking

We used the AutoDock Vina program (http://vina.scripps.edu/index.html, version 1.1.2) to build the drug-mutant and ATP-mutant structures and calculate the binding scores 69 . Default AutoDock Vina parameters were used. The superposition module in Schrödinger 70 was used to calculate the RMSD of ATP in the crystal structure and in the mutants.

ABL structures

During the simulation, we used different ABL crystal structures for different compounds. The structure of ABL complexed with ATP was derived from the ATP-peptide conjugate complex (PDB code: 2G1T) with the protein in an inactive conformation 71 . The structure used for imatinib was 2HYY with the complexed protein in an inactive conformation 72 . The structure used for nilotinib was 3CS9 with the complexed protein in an inactive conformation 73 . For dasatinib, we used 2GQG with the complexed protein in an active conformation 48 . Ponatinib was designed for the T315I mutant. It avoids steric hindrance with the side chain of isoleucine. 3IK3 (with a T315 mutation) complexed with ponatinib was also used. The mutant protein 3IK3 adopts an inactive conformation 62 . The wide-type protein structure in this case was obtained by mutating I315 back to T315.

EGFR structures

The structure of EGFR tyrosine kinase domain in complex with ATP was derived from the thiophosphoric acid O-[(adenosyl-phospho)phosphor]-S-acetamidyl-diester complex (PDB code: 2GS6) with the protein in an active conformation 74 . The structure used for gefitinib was 4I22 with the complexed protein in an active conformation 75 .

Compounds and substrates

Imatinib (MW493.6), nilotinib (MW529.52), dasatinib (MW488.01), and ponatinib (MW532.56) were purchased from Selleck (https://www.selleck.cn/). The substrate peptide was obtained from GL Biochem (Shanghai) Ltd. and had a sequence of Lys-Lys-Gly-Glu-Ala-Ile-Tyr-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-NH2 (Directory peptide Cat # 86721).

Expression and purification of ABL and mutants

The kinase domains of human c-ABL (residues 222–500, NM_005157.5) were subcloned into the Ndemoi et XhoI restriction sites of the pET-28a vector 76 . The plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) cells, plated on LB agar containing kanamycin (50 μg mL −1 ), and grown overnight at 37 °C. The next day, the colonies from the plates were resuspended in expression media (LB agar containing kanamycin, 50 μg mL −1 ). Cultures were grown to an OD600 of 1.2 at 37 °C and cooled for 1 h with shaking at 16 °C prior to induction for 22 h at 16 °C with 0.1 mM IPTG. Cells were harvested by centrifugation at 7000 × g at 4 °C for 15 min and stored at −80 °C. The bacterial pellet was resuspended in Buffer A [50 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazole] for immediate purification using nickel ion affinity chromatography. Elution of the protein from the column was achieved using a Buffer B gradient [50 mM Tris, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole (pH 8.0)], which increased from 0% to 100% over 15 min. The eluted protein was concentrated to 2 mL and subjected to gel filtration using an S200 column 77,78 . The buffer used for the gel filtration was Buffer C [50 mM Tris, 500 mM NaCl (pH 8.0)]. The protein was eluted at 55 min. The purity of the protein was verified by SDS-PAGE.

For the mutants, primers were designed based on the predicted mutations and synthesized by GENEWIZ. Mutations were made using the Fast Site-Directed Mutagenesis kit from TIANGEN, according to the manufacturer’s instructions, and verified by DNA sequencing. The mutant proteins were expressed and purified following the expression and purification of the wt protein.

In vitro kinase inhibition assay

To assess the ability of the drug to inhibit the wt and mutant kinases, we used the ADP-Glo Kinase Assay kit from Promega 79 , which measures the amount of ADP produced in the reaction. The inhibition rates of the drugs at different concentrations were calculated by comparing the amount of ADP produced with and without the drug. Data were analyzed using the Hill1 model in the OriginLab2018 software package.

In vitro enzyme activity assay

ITC experiments were carried out using an ITC200 instrument (Microcal Inc.). ITC has been demonstrated to directly measure the kinetics and thermodynamic parameters (k chat, K M,H) of enzymatic reactions 80 . A one-step method was used to measure the enzymatic parameters. The BCR-ABL concentration was in the nanomolar range, with the ATP/substrate concentration at least three orders of magnitude higher than the enzyme concentration and above the K M [BCR-ABL (10 nM) and substrate (1 mM) in the cell, and ATP (1 mM) in the syringe].

The thermal change (Q) is proportional to the reaction enthalpy (ΔH) and the number of moles of product (m), whereas the moles of product equal the total volume (V) multiplied by the concentration [P]:

According to Eq. (3), the ΔH of the reaction can be obtained by integrating the curve of the Method 1 experiment


Result and Discussion

Experimental studies shows that the ligands (Table 2) used in this study are good antileishmanials ( 4-15 ), but docking of these compounds revealed a great variation in their binding energy. Initially, totally five poses were saved from which best pose with lowest energy was chosen for each compound. Although the predicted free energy of binding is a useful descriptor of ligand–receptor complementarity, the choice of the ‘best’ docking model was ultimately dictated by various parameters of ADME/T study. Our results show that several compounds were not following the given range limit of few ADME/T properties. These include PISA (1/4 component, i.e. carbon and attached hydrogens of the SASA range, 0–400 Å 2 ), QlogPC16 (predicted log of hexadecane/gas partition coefficient range, 4–18), QlogPo/w (predicted log of octanol/water partition coefficient range, −2 to 6), QlogS (Predicted log of aqueous solubility range, −6 to 0.5 m ). QPPMDCK (predicted apparent MDCK cell permeability range, poor < 25 nm/seconds and great > 500 nm/seconds), QPlogHERG (predicted IC50 value of blockage of HERG K+ channel range, <−5) were also found to be violated by 2, 5-bis-(4-amidinophenyl)thiophene (5c) and berenil, respectively (not shown in Table 4).

S. No Compound id G score SASA FOSA FISA PISA WPSA Vol QPpolrz QPlogPC16 QPlogPoct QPlogPw QPlogPo/w QPlogS QPlogHERG PHOA Rule of five Toxicité
1 1a −5.987491 560.887 190.08 127.05 243.8 0 945.45 32.727 9.978 17.222 11.989 2.019 −4.088 −5.436 88.721 0 NON
2 1b −4.727568 N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A NON
3 1c −4.637121 738.471 0 98.531 639.9 0 1291.9 49.089 16.002 22.977 14.476 4.779 6.764 −8.195 100 0 NON
4 2a −5.621212 N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A NON
5 2b −6.474291 551.198 374.14 3.851 173.2 0 1002.4 34.331 8.879 13.409 6.734 3.049 −2.499 −5.046 100 0 NON
6 2c −5.619455 734.312 512.31 176.53 45.47 0 1196 39.575 12.012 23.791 15.36 1.983 −5.99 −5.923 67.157 1 NON
7 2d −5.509143 N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A Haute
8 3 −10.93399 564.425 0 266.67 297.8 0 934.31 28.302 12.334 23.996 19.586 −0.02 −2.279 −5.883 40.131 1 NON
9 4a −11.09014 767.378 426.04 121.51 149.4 70.47 1374.1 45.769 13.979 23.249 12.698 4.021 6.408 −5.821 100 0 NON
10 4b −12.05836 573.216 0 220.97 352.2 0 972.25 32.267 12.575 22.054 15.909 1.681 −3.356 −5.995 57.842 1 NON
11 5a −10.94681 851.379 0 125.74 624.8 100.9 1506.4 54.963 19.511 29.664 16.42 6.064 8.293 −8.614 86.713 2 NON
12 5b −11.71767 889.017 152.68 88.545 571.1 76.73 1632.1 58.194 19.809 29.374 16.427 6.575 8.222 −8.235 96.017 2 NON
13 5c −11.4314 429.265 218.29 210.98 0 0 692.77 21.571 6.541 35.538 6.102 1.414 −3.354 −3.44 57.975 1 NON
14 5d −11.41968 911.9 152.18 102.79 605.6 51.37 1647.7 59.149 20.27 29.734 16.805 6.506 8.509 −8.63 93.195 2 NON
15 5e −10.88554 603.176 0 225.4 349.5 28.32 1020.4 34.168 13.239 22.196 15.51 2.19 −4.031 −6.23 60.07 1 NON
16 6 −9.29 537.669 484.39 53.272 0 0 966.55 31.243 8.127 14.109 6.819 2.467 −2.056 −4.93 82.28 0 NON
  • SASA, total solvent accessible surface area (range, 300–1000 Å 2 ) FOSA, hydrophobic component of the SASA (range, 0–750 Å 2 ) FISA, hydrophilic component of the SASA (range, 7–330 Å 2 ) PISA, 1/4 component of the SASA (range, 0–400 Å 2 ) WPSA, weakly component of SASA (range, 0–150 Å 2 ) Volume, total solvent accessible area (range: 500–2000 Å 3 ) QPpolrz, Predicted polarizability (range, 13–70 Å 3 ) QPlogPC16, rredicted log of hexadecane/gas partition coefficient (range, 4–18) QPlogPoct, predicted log of octanol/gas partition coefficient (range, 8–43) QPlogPw, predicted log of water/gas partition coefficient (range, 5–48) QPlogPo/w predicted log of octanol/water partition coefficient (range, −2 to 6) QplogS, predicted log of aqueous solubility (range, −6 to 0.5 m ) QPlogHERG, predicted IC50 value for blockage of HERG K+ channels (range, concern below −5) PHOS, per cent human oral absorption GScore, Glide Score.
  • The values in bold are out of range from the category of drug.

Hydrophobic drugs with high partition coefficients are preferentially distributed to hydrophobic compartments such as lipid bilayers of cells while hydrophilic drugs (low partition coefficients) preferentially are found in hydrophilic compartments such as blood serum. As adequate solubility and permeability is a prerequisite for drug absorption from the gastrointestinal tract, it plays a significant role for the resulting bioavailability of orally administered drugs. By violating these properties, a compound may be associated with side-effects, high or poor solubility (QlogS) that can result in poor absorption and distribution in the body.

The interactions and other scores resulted from docking studies for each compound are summarized in Table 5. The results are briefly described in the following section.

Ligand Récepteur Interaction
LIG.NH (37) DT4.A.O2 (148) Hydrogen bond
LIG DA6.A Hydrophobic
LIG DT7.A Hydrophobic
LIG DT18.B Hydrophobic
LIG DA19.B Hydrophobic

Acridine and its derivatives

Acridine family includes a wide range of tricyclic molecules with various biologic properties. Considered as potential antiparasitic agents since the 1990s, numerous acridine derivatives have been synthesized and successfully assessed for their antimalarial, trypanocidal or antileishmanial properties ( 19-21 ). According to a previous study, N-[6-(acetylamino)-3-acridinyl] acetamide (compound 1c) et N-[6-(benzoylamino)-3-acridinyl] (compound 1b) benzamide demonstrated highly specific antileishmanial properties against the intracellular amastigote form of the parasite ( 12 ). But our docking score suggests that only acridine (compound 1a GScore, −5.987491) was the best with no violation of any ADME/T descriptor (Table 4). Composé 1c was found to violate few ADME/T properties when analyzed by QikProp.

Berberin and its derivatives:

Berberine, a quaternary alkaloid and a minor groove binder ( 23 ), has demonstrated experimental and clinical efficacies against both visceral ( 4, 6, 7 ) and cutaneous ( 4 ) leishmaniases. Despite the apparent potential of this compound as an antileishmanial drug, only Putzer ( 22 ) has described the antileishmanial activity of derivatives of berberine and failed to present any biologic or chemical data to substantiate his claims. Further, in support of this study, Vennerstrom et al. ( 9 ) suggested that tetrahydroberberine (2c) was proven less toxic and more potent against Leishmania donovani than berberine (2a), N-methyl tetrahydro berberinium iodide (2b), berberine chloride (2d). In contrast to these results, we have found major variation in the data when applied in silico automated docking calculations. Our results show that N-methyl tetrahydro berberinium iodide (compound 2b) was having the best GScore (−6.474291) among all with no violence of ADME/T parameters. When studied using ToxTree software, berberine chloride (compound 2d) was analyzed as highly toxic among the all compounds (Table 4).

Berenil

Berenil (diminazene aceturate), a minor groove binder in AT-rich domain ( 24 ), has been proven a good antileishmanial previously ( 5, 8 ). Notre in silico docking calculation with a GScore of −10.93398 and ADME/T study with no violence of any parameters is in agreement with previous studies (Table 4).

Pentamidine and its derivatives

Pentamidine (compound 5a) is one of the few antileishmanial drugs currently available. It belongs to the diamidine class of drugs, which has been suggested to exert antiparasitic activity by binding to DNA, interfering with polyamine metabolism and disrupting of mitochondrial membrane potential ( 25 ). Typically, these dicationic molecules bind to DNA by selectively interacting with AT-rich regions of the minor groove. The complementarity of the curvature of the dicationic molecules with that of the minor groove of DNA has been considered an important determinant in the interaction of such groove binders with DNA ( 26, 27 ). Pentamidine is already in clinical use but limited by toxicity, administration by injection, and development of resistance ( 10 ). In addition to pentamidine, many of diamidine molecules –N-[2-(methylsulfanyl)-4-<5-[3-(methylsulfanyl)-4-(pyridine-2-imidamido) phenyl] fura N-2-Yl> phenyl] pyridine-2-carboximidamide (5b), 2 5-bis-(4-amidinophenyl)thiophene (5c), N-(3-chloro-4-<5-[2-chloro-4-(pyridine-2-imidamido) phenyl] fura N-2-yl> phenyl) pyridine-2-carboximidamide (5d), 2 4-bis-(4-amidinophenyl)furan (5e) – exhibited promising activity against Leishmania. The antileishmanial activity of several such dicationic molecules was reported earlier ( 10, 11, 13, 28 ).

Docking studies of these compounds including pentamidine reveal that all these compounds were scored a good GScore, but only compounds 5c et 5e satisfied the ADME/T parameters’ range and other three compounds viz. 5a, 5b, 5d seemed to violate few filters.

Diindolyl methane

(3,3′)-Diindolylmethane (DIM, compound 6) is a natural compound, product of acid condensation of indole-3-carbinol (I3C), found in most cruciferous vegetables of the genus Brassica. DIM inhibits an unusual bisubunit topoisomerase I from L. donovani and has been found to interact both with free enzyme and with DNA. A study has been carried out to verify the interaction between DIM-DNA ( 15 ). Their data and our result of its in silico interaction with DNA (GScore, −9.29) and ADME/T study showed that the compound can be a future drug molecule.

Duocarmycine and its derivative

The duocarmycins bind to the minor groove of DNA and alkylate the nucleobase adenine at the N3 position ( 29 ). Seco-hydroxy-aza-CBI-TMI, analog of duocarmycin (4a), was shown to inhibit the growth of the protozoan parasites L. donovani, Leishmania mexicana, in culture ( 14 ). Seco-hydroxy-aza-CBI-TMI (4b) was also shown (Figures 1 and 2) to score a good binding energy (GScore, −12.058362), and the study of ADME/T parameters with no violence of any parameters is in agreement with the previous studies (Table 4).

Illustration of binding pocket of seco-hydroxy-aza-CBI-TMI in DNA: (A) and (B) Ligand is shown as stick and DNA residues as wire. Possible hydrogen bond is shown as yellow thick line with the atoms and distance (2.844 Å).

(A) Ligand is shown in active site pocket. Active site residues are shown as surface. (B) 2D view of the complex (generated by Poseview v1.0.0 BioSolveIT GmbH, Sankt Augustin, Germany). Hydrogen bond is shown as dashed line, and residues taking part in hydrophobic interaction are in green color. Hydrophobic interactions are shown as green line.


Experimental Section

Cytotoxicity Assay

HeLa cells were seeded on 96-well tissue culture plates at 1.0 × 10 4 cells/well. After incubation in a humidified atmosphere containing 5% CO2 for 24 h at 37ଌ in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% FBS, the cells were washed with Leibovitz’s L-15 medium and treated with TAT, E3-TAT, and E5-TAT in L-15. After 1 h incubation, the cells were washed with fresh L-15 medium and incubated at 37ଌ for 3 hours. The number of live cells present in each well was then determined using the Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular probes, Carlsbad, CA). Alternatively, SYTOX® Blue, a nucleic acid fluorescent stain that only penetrates cells with compromised plasma membranes, was used to measure cell-viability by fluorescence microscopy imaging.

Live Cell Assay for the Transduction of Fluorescent Imaging agents

HeLa, COS-7 and COLO 316 cells were seeded on 8-well chamber glass slide at 3.0 × 10 4 cells/well in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% FBS and incubated for 24 h at 37ଌ in a humidified atmosphere containing 5% CO2. Cells were then incubated with L-15 medium (no FBS added) and placed on an inverted epifluorescence microscope (Model IX81, Olympus, Center Valley, PA) equipped with a heating stage maintained at 37ଌ. The microscope is configured with a spinning disk unit to perform both confocal and wide-field fluorescence microscopy. Images were collected using a Rolera-MGI Plus back-illuminated EMCCD camera (Qimaging, Surrey, BC, Canada). Images were acquired using phase contrast and three standard fluorescence filter sets: CFP (Ex = 436넠 nm / Em= 480녀 nm), Texas Red (Ex = 560녀 nm / Em= 630녵 nm), and FITC (Ex = 482넵 nm / Em= 536녀 nm). Cells were co-treated with of TAT or E3/E5-TAT (2 µM) in L-15 medium containing fluorescent imaging agents at 10 µM for the fluorescent proteins EGFP, mCherry, and tdTomato (obtained as previously described) and 2.5 mg/mL for the dextrans 10 and 70 kDa anionic Dextran-fluorescein, 10 and 70 kDa neutral Dextran-tetramethylrhodamine, and 70 kDa neutral Dextran-Texas Red.[10] After incubation at 4 or 37ଌ for 15 or 60 minutes, the cells were washed with PBS 5 times and the medium was replaced with fresh L-15. The integrity of the plasma membrane of the cells was determined by addition of the cell-impermeable DNA stain SYTOX® Blue. Cells with a blue fluorescent nucleus, detected with the CFP filter set, were considered compromised or dead. The cells that were not stained by SYTOX® Blue were further confirmed to be alive by detection of active transport of intracellular endocytic vesicles. To inhibit cell surface binding of the delivery peptides, heparin sodium salt (1 mg/mL) was added during the co-incubation step. To inhibit acidification of the endolysosomal organelles, cells were pretreated with bafilomycin (200 nM) for 20 min. Cells were then co-incubated with the fluorescent macromolecules and the delivery peptides in L-15 supplemented with bafilomycin (200 nM). The fluorescence intensities within cells were measured using the SlideBook 4.2 software (Olympus, Center Valley, PA). The mean intensity within cells imaged with the FITC or Texas Red filters was measured as the total intensity of the cell divided by its area. The same protocol was used for cells with either punctate or diffuse distributions. Mean fluorescence intensities were measured over a population of 3000 cells and experiments were reproduced 3 times.

Live Cell Assay for the delivery of PAD

Cells grown on 96-well plates were treated with PAD (20 µM) and TAT (5 µM) or E5-TAT (3, 5, or 7 µM) in L-15. For the inhibition of macropinocytosis, cells were first pretreated with 50 µM of amiloride (Sigma, MO) for 30 minutes, and then with the peptides while keeping amiloride present. After 1 h incubation, the cells were washed with fresh L-15 medium again and incubated at 37ଌ for additional 3 hours. The number of live cells present in each well was then determined using the Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular probes, Carlsbad, CA). After 1 h incubation the cells were washed with L-15. SYTOX® Blue (5 µM) was added and cells were incubated for 15 min at 37ଌ. Cells were then placed on the microscope and images were acquired in the blue fluorescence channel for detection of SYTOX® Blue and red fluorescence channel for detection of TMR.


Structures in the collection

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An MW Collection

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A double-stranded DNA molecule. Hydrogens are shown because this structure was solved by NMR.

A double-stranded DNA molecule. Hydrogens are not seen because this structure was solved by X-ray diffraction.


DNA Intercalation by Quinacrine and Methylene Blue: A Comparative Binding and Thermodynamic Characterization Study

There is compelling evidence that cellular DNA is the target of many anticancer agents. Consequently, elucidation of the molecular nature governing the interaction of small molecules to DNA is paramount to the progression of rational drug design strategies. In this study, we have compared the binding and thermodynamic aspects of two known DNA-binding agents, quinacrine (QNA) and methylene blue (MB), with calf thymus (CT) DNA. The study revealed noncooperative binding phenomena for both the drugs to DNA with an affinity one order higher for QNA compared to MB as observed from diverse techniques, but both bindings obeyed neighbor exclusion principle. The data of the salt dependence of QNA and MB from the plot of log K versus log [Na + ] revealed a slope of 1.06 and 0.93 consistent with the values predicted by theories for the binding of monovalent cations, and have been analyzed for contributions from polyelectrolytic and nonpolyelectrolytic forces. The binding of both drugs was further characterized by strong stabilization of DNA against thermal strand separation in both optical melting and differential scanning calorimetry studies. The binding data analyzed from the thermal denaturation and from isothermal titration calorimetry (ITC) were in close proximity to those obtained from spectral titration data. ITC results revealed the binding to be exothermic and favored by both negative enthalpy and positive entropy changes. The heat capacity changes obtained from temperature dependence of enthalpy indicated −146 and −78 cal/(mol·K), respectively, for the binding of QNA and MB to CT DNA. Circular dichroism study further characterized the structural changes on DNA upon intercalation of these molecules. Molecular aspects of interaction of these molecules to DNA are discussed.


Voir la vidéo: Biologie - Quest-ce que lADN DNA in English (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Abarron

    Les choses vont nagement.

  2. Ninris

    Je partage entièrement son point de vue. Je pense que c'est une bonne idée. Entièrement d'accord avec elle.

  3. Ameretat

    Si j'étais vous, je me tournerais vers les moteurs de recherche pour obtenir de l'aide.

  4. Tunde

    Oui, ce message intelligible

  5. Mogor

    Tout à fait, oui



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