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9E : Analyse du contrôle métabolique et biologie des systèmes - Biologie

9E : Analyse du contrôle métabolique et biologie des systèmes - Biologie


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Objectifs d'apprentissage

  • décrire l'état d'équilibre dans le contexte d'une réaction isolée catalysée par une enzyme et pour l'enzyme lorsqu'elle fait partie d'une voie métabolique complexe in vivo ;
  • indiquer et décrire ce qui est requis pour effectuer une analyse de contrôle métabolique sur une voie biologique ;
  • écrire des équations différentielles ordinaires pour décrire le changement de concentration d'analytes dans un ensemble donné de réactions couplées ;
  • écrire des expressions de bilan massique pour Eo et les utiliser pour calculer la fraction de chaque forme d'enzyme en supposant un équilibre rapide ;
  • tracer des diagrammes "en fil" montrant l'activation et l'inhibition des réactions couplées ;
  • définir verbalement et sous forme d'équation mathématique le coefficient de contrôle du flux et expliquer comment l'obtenir graphiquement ;
  • utiliser des coefficients de contrôle de flux pour expliquer comment le contrôle du flux dans une voie est distribué à travers toutes les réactions catalysées par des enzymes dans cette voie ;
  • analyser le résultat d'une analyse de contrôle de flux d'une voie comme la glycolyse ;
  • décrire pourquoi de petits changements dans les enzymes qui ont les plus grandes valeurs de ΔG dans la glycolyse ont des effets mineurs sur le flux métabolique dans la glycolyse ;
  • définir le coefficient de contrôle de la concentration verbalement et sous la forme d'une équation mathématique
  • analyser le résultat d'une analyse de contrôle de concentration d'une voie telle que la glycolyse ;
  • définir le coefficient d'élasticité verbalement et sous forme d'équation mathématique, et expliquer comment l'obtenir graphiquement
  • indiquer si les différents coefficients de contrôle métabolique sont des propriétés globales du système ou des propriétés locales d'une enzyme donnée

BIOCHIMIE - DR. JAKUBOWSKI

Buts d'apprentissage/objectifs pour le chapitre 9E :
Après le cours et cette lecture, les élèves pourront

  • décrire l'état d'équilibre dans le contexte d'une réaction isolée catalysée par une enzyme et pour l'enzyme lorsqu'elle fait partie d'une voie métabolique complexe in vivo
  • énoncer et décrire ce qui est requis pour effectuer une analyse de contrôle métabolique sur une voie biologique
  • écrire des équations différentielles ordinaires pour décrire le changement de concentration d'analytes dans un ensemble donné de réactions couplées
  • écrire des expressions de bilan massique pour Eo et les utiliser pour calculer la fraction de chaque forme d'enzyme en supposant un équilibre rapide
  • dessiner des diagrammes "fil" montrant l'activation et l'inhibition des réactions couplées
  • définir le coefficient de contrôle de flux verbalement et sous forme d'équation mathématique, et expliquer comment l'obtenir graphiquement
  • utiliser des coefficients de contrôle de flux pour expliquer comment le contrôle du flux dans une voie est distribué à travers toutes les réactions catalysées par des enzymes dans cette voie
  • analyser le résultat d'une analyse de contrôle de flux d'une voie comme la glycolyse
  • décrire pourquoi de petits changements dans les enzymes qui ont les plus grandes valeurs de ΔG dans la glycolyse ont des effets mineurs sur le flux métabolique de la glycolyse
  • définir le coefficient de contrôle de la concentration verbalement et sous la forme d'une équation mathématique
  • analyser le résultat d'une analyse de contrôle de concentration d'une voie comme la glycolyse
  • définir le coefficient d'élasticité verbalement et sous forme d'équation mathématique, et expliquer comment l'obtenir graphiquement
  • indiquer si les différents coefficients de contrôle métabolique sont des propriétés globales du système ou des propriétés locales d'une enzyme donnée.

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Biochemistry Online par Henry Jakubowski est sous licence Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.


E2. Principes de base de l'analyse du contrôle métabolique (ACM)

Une variété d'entrées est requise pour de telles analyses informatiques :

une. Chemins définis. Ceux-ci sont disponibles dans de nombreuses bases de données. Un exemple de voies KEGG pour la glycolyse de levure est présenté ci-dessous

b. Un programme de modélisation informatique pour saisir tous les paramètres, équations, modèles et calculer les concentrations pour toutes les espèces en fonction du temps. Les programmes gratuits et téléchargeables qui le font incluent COPASI, Virtual Cell et Cell Designer. Un exemple de modèle cartographié de Cell Designer pour la glycolyse de levure avec plusieurs réactions supplémentaires dérivées de la voie glycolytique classique est présenté ci-dessous.

Les résultats des calculs des analyses de la glycolyse de la levure n'ont pu s'adapter aux données expérimentales que s'ils étaient corrigés par l'ajout de plusieurs réactions de branchement (illustrées dans les figures ci-dessus et ci-dessous) :

c. Une liste de toutes les espèces impliquées dans la voie (montrée dans la figure ci-dessous pour les réactions de glycolyse et de ramification).

ré. Une liste de toutes les réactions (ci-dessous pour les réactions de glycolyse et de ramification, tirée de COPASI)

e. Paramètres de toutes les espèces. Un exemple est présenté ci-dessous pour l'hexokinase (tiré de COPASI).

F. Équations qui peuvent être utilisées pour calculer l'évolution des concentrations de toutes les espèces avec le temps. Ce sont généralement des équations différentielles ordinaires (EDO) comme décrit dans le chapitre 6B - Cinétique des réactions simples et catalysées par des enzymes, sections B1 : Réactions à une seule étape.) Les EDO sont faciles à écrire mais nécessitent un ordinateur pour les résoudre à mesure que le nombre d'espèces en interaction augmente. .

Un exemple de réaction chimique et un ensemble d'EDO pour chaque espèce sont présentés ci-dessous.

Si une réaction supprime l'espèce X, le côté droit de l'ODE pour la disparition de cette espèce a un signe - pour ce terme. De même, si une réaction augmente l'espèce X, le membre de droite a un signe +. Les exemples ci-dessus montrent des réactions unimoléculaires (C à D, C à A + B) et bimoléculaires (A+B à C).

Un exemple d'ODE tiré de COPASI est montré ci-dessous pour le changement de concentration de glucose-6-phosphate.

Des bases de données contenant des modèles organisés avec toutes les informations ci-dessus ont été développées pour de nombreuses voies. Le modèle de glycolyse de levure décrit ci-dessus se trouve dans la base de données Biomodels. Le modèle, BIOMD0000000064, peut être téléchargé en tant que fichier de langage de balisage de biologie des systèmes (SBML) et importé dans l'un des programmes décrits ci-dessus.
Les graphiques ci-dessous montrent les concentrations pour certaines espèces et toutes les espèces en fonction du temps pour la glycolyse de levure en utilisant COPASI.

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La cinétique enzymatique peut sembler difficile étant donné les dérivations mathématiques compliquées, le nombre d'espèces chimiques impliquées (une enzyme et tous ses substrats et produits), le nombre d'étapes du mécanisme et le grand nombre de constantes de vitesse, de cinétique et de dissociation. Un exemple d'une telle réaction « compliquée » exploré précédemment est présenté ci-dessous :

Mais les enzymes simples agissent rarement de manière isolée. Ce sont des composants de voies complexes qui comportent une multitude d'étapes, dont beaucoup sont régulées. Pour bien comprendre une réaction, il est important d'étudier les concentrations de toutes les espèces dans l'ensemble de la voie en fonction du temps. Imaginez dériver les équations et déterminer toutes les concentrations et constantes pertinentes d'une voie telle que la glycolyse !

Pour étudier la cinétique enzymatique en laboratoire, vous devez passer beaucoup de temps à développer des tests pour mesurer comment la concentration des espèces change en fonction du temps pour pouvoir mesurer les vitesses initiales d'une réaction catalysée par une enzyme. Cependant, dans les réseaux de réactions métaboliques connectées, la concentration de certaines espèces dans le système peut ne pas changer. Comment cela peut-il arriver ? Deux exemples simples pourraient aider à expliquer comment.

Exemple 1 : Il n'y a aucune entrée ou sortie d'une réaction donnée. Cela se produirait dans un système fermé pour une réaction réversible à l'équilibre.

Pour une réaction réversible du réactif R allant au produit P avec des constantes de vitesse directe et inverse du premier ordre, l'équation suivante peut être écrite à l'équilibre :

A l'équilibre, R et P ne changent pas.

Exemple 2 : Considérez la réaction comme faisant partie d'une voie de réactions (comme un système ouvert). Imaginez maintenant une entrée non nulle pour former le réactif R et une sortie non nulle qui consomme le produit P. Si les taux d'entrée et de sortie sont les mêmes, les concentrations de R et P ne changeront pas avec le temps. C'est-à-dire que la vitesse de formation d'un réactif R pour une réaction donnée est égale à la vitesse à laquelle le produit P de la réaction donnée est utilisé. Cela conduirait à un état stationnaire mais pas à une concentration d'équilibre de l'espèce.

Comprendre une enzyme pure in vitro et in vivo nécessite des approches différentes. Les biochimistes aiment isoler et purifier jusqu'à homogénéité une enzyme présente dans certains tissus et étudier son mécanisme d'action. En effectuant des mesures thermodynamiques pour mesurer les constantes d'équilibre (Kéq) ou des constantes de dissociation (K), à partir de laquelle ΔG 0 peut être calculé, une concentration en protéine est généralement maintenue constante lorsque la concentration en ligand de liaison varie (variable indépendante). Un signal variable dépendante (souvent spectroscopique) est mesuré. Les mesures sont effectuées lorsque l'équilibre est atteint.

Pour les mesures cinétiques enzymatiques in vitro, la concentration enzymatique est généralement maintenue constante tandis que le substrat et les modificateurs sont modifiés (variables indépendantes) pour déterminer comment la vitesse (variable dépendante) change. La vitesse est déterminée par la concentration du substrat. Lorsque l'inhibition est étudiée, le substrat est varié tandis que l'inhibiteur est maintenu constant à plusieurs concentrations fixes différentes.

In vivo, la concentration en substrat et même la concentration en enzyme sont déterminées par la vitesse. Comparez à nouveau cela à la cinétique in vitro lorsque les concentrations déterminent la vitesse
Pour les ensembles de réactions dans les voies, il est préférable d'utiliser le terme flux, J. En régime permanent, les flux d'entrée et de sortie pour une réaction donnée sont identiques. Le flux J est utilisé pour décrire le taux du système tandis que le taux ou la vitesse v utilisé décrit le taux d'une enzyme individuelle dans un système.

Les programmes informatiques peuvent trouver des concentrations d'états stables en trouvant les racines des équations différentielles ordinaires (ODE) lorsqu'elles sont réglées sur zéro (vF = vr). Pour modéliser un processus à de très faibles concentrations, les programmes peuvent également utiliser des simulations probabilistes ou stochastiques pour modéliser les distributions de probabilité pour les espèces et leur évolution dans le temps pour un nombre fini de particules. Dans de telles simulations, les concentrations (mM) sont placées avec le nombre de particules. Les EDO ne fonctionnent pas bien pour décrire ces conditions car les changements de concentrations ne sont pas continus.

Revenons maintenant à notre question rhétorique précédente consistant à dériver les équations et à déterminer toutes les concentrations et constantes pertinentes d'une voie telle que la glycolyse ! Cela a en fait été fait par Teusink et al pour la glycolyse dans la levure. En fait, de nombreuses voies métaboliques et de transduction du signal complexes ont été modélisées mathématiquement dans l'espoir de mieux comprendre les réponses cellulaires et organiques. La modélisation quantitative et la prédiction des intrants, des extrants et des concentrations de toutes les espèces dans des voies complexes constituent la base de la biologie des systèmes.

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Discussion

L'objectif à long terme de la biologie des systèmes est la génération de modèles mathématiques prédicatifs pour décrire et comprendre les processus cellulaires et les phénotypes basés sur des données moléculaires. Pour atteindre cet objectif, des mesures précises, reproductibles et cohérentes des concentrations absolues d'analytes dans de nombreuses conditions sont cruciales. Parmi les différentes biomolécules d'une cellule, les protéines jouent un rôle central, car elles sont activement impliquées dans presque tous les processus cellulaires et de nombreux événements biochimiques importants ne peuvent être déduits de la mesure génomique ou transcriptomique (Liu et Al, 2016). Les progrès récents dans le domaine de la protéomique, comme la spectrométrie de masse DIA/SWATH en combinaison avec de nouvelles stratégies d'analyse de données, ont mûri de telle sorte qu'il est possible d'obtenir des mesures précises de milliers de protéines de manière reproductible sur de nombreux échantillons. Cependant, l'obtention d'abondances absolues précises pour les protéines faiblement exprimées reste un défi. Actuellement, les connaissances biologiques dérivées d'études protéomiques quantitatives de E. coli proviennent principalement de niveaux à gros grains, par exemple, sur les abondances totales d'enzymes participant à une voie métabolique (Hui et Al, 2015 Schmidt et Al, 2016 ), mais pas à partir de protéines individuelles.

Dans cet article, nous avons développé un flux de travail polyvalent pour obtenir des abondances absolues pour des milliers de protéines au niveau de chaque protéine dans un grand nombre de conditions. La spectrométrie de masse DIA/SWATH a été utilisée pour générer des profils d'intensité de précurseurs peptidiques de haute qualité à un débit élevé et à des coûts minimes. Pour l'analyse des données DIA/SWATH centrée sur les peptides, un E. coli bibliothèque spectrale comprenant 64% de tous les annotés E. coli protéines (2 770 protéines) a été générée. Un nouvel algorithme d'inférence de protéines, appelé xTop, a été utilisé pour déduire avec précision les intensités des protéines à partir des intensités des précurseurs peptidiques. xTop prend en compte tous les précurseurs peptidiques détectés pour une protéine donnée dans tous les échantillons, réduisant ainsi l'effet du bruit et des valeurs manquantes dans l'ensemble de données, et produisant une meilleure quantification relative par rapport aux méthodes d'inférence couramment utilisées telles que iBAQ et TopPep1/3 (Fig 2 ).

Pour obtenir des fractions de masse de protéines absolues, nous avons évalué diverses méthodes de quantification à l'aide d'un ensemble d'échantillons d'étalonnage impliquant des réplicats biologiques et techniques de la même condition. Les fractions massiques absolues obtenues à partir des données protéomiques avec divers algorithmes d'inférence et des données de profilage des ribosomes ont été évaluées à l'aide (i) d'un ensemble de protéines d'ancrage pour lesquelles des abondances précises de protéines ont été mesurées avec des peptides synthétiques marqués par des isotopes stables (AQUA), et (ii) plusieurs complexes protéiques de stoechiométrie connue. Parmi ces méthodes, le profilage des ribosomes a donné la quantification la plus précise, au moins pour les protéomes qui ne sont pas significativement dégradés par rapport à la dilution par le taux de croissance (Koch & Levy, 1955 Mandelstam, 1958). Comme il est impossible d'utiliser le profilage des ribosomes pour examiner de nombreux échantillons en parallèle, nous avons utilisé le profilage des ribosomes comme norme pour mesurer les fractions massiques absolues des protéines et l'avons combiné avec une quantification relative précise sur de nombreux échantillons offerts par DIA/SWATH et la méthode d'inférence de protéines xTop.

Le flux de travail polyvalent résultant a été utilisé pour quantifier l'abondance absolue de 2 335 protéines pour divers E. coli souches cultivées dans 66 conditions, y compris des conditions de stress et des états non planctoniques jamais caractérisés auparavant. Les abondances absolues sont rapportées en termes de fractions massiques de protéines, ce qui correspond directement aux concentrations de protéines cellulaires, quels que soient les changements possibles de la taille des cellules dans les conditions de croissance (note d'annexe S1). Notre ensemble de données quantitatives comprend des protéines peu abondantes avec des fractions massiques de protéines cellulaires aussi petites que 10 -5 du protéome, correspondant à des concentrations proches de 30/μm 3 pour une protéine de taille moyenne (

60 copies par cellule pour les cellules en croissance en milieu glucose minimal), ainsi que des protéines très abondantes avec des fractions massiques de protéines cellulaires proches de 10 % (300 000/μm 3 ,

Nous avons comparé les résultats de cette étude à des études antérieures sur le protéome de E. coli. Peebo et Al ( 2015 ) étudié E. coli BW25113 cultivé en chémostat (Peebo et Al, 2015). Nous avons comparé leurs résultats obtenus en milieu glucose minimal aux nôtres pour MG1655 (EQ353) cultivé en culture discontinue de glucose. Leur étude a montré une couverture protéique plus faible (environ 60% de la nôtre). Pour les protéines détectées (plus fortement exprimées), leurs abondances absolues étaient en bon accord avec les nôtres (annexe Fig S14A et symboles bleus dans l'annexe Fig S14D). Schmidt et Al (2016) ont principalement étudié BW25113 dans une variété de cultures discontinues et continues, mais ont également fourni des données pour MG1655 dans un milieu de glucose pour comparaison avec d'autres études (Schmidt et Al, 2016). Nous avons comparé ces derniers à nos résultats pour MG1655 (EQ353) en culture d'appariement de glucose. Alors que le nombre de protéines détectées était comparable (1 901 contre 1 843), nous avons observé une sous-estimation systématique des protéines peu abondantes (annexe Fig S14B) et une plus grande variance dans la stoechiométrie des complexes protéiques connus par rapport à nos données (bleu clair dans l'annexe Fig S14D). Ces résultats sont cohérents avec le biais de la méthode iBAQ utilisée dans ce travail pour déduire les abondances de protéines comme discuté précédemment (Annexe Figs S4D et S5). Enfin, Caglar et Al ( 2017 ) ont signalé des abondances de protéines pour E. coli B (REL606) dans un certain nombre de conditions (Caglar et Al, 2017). Nous avons comparé leurs données pour le milieu minimal de glucose en croissance exponentielle au même ensemble de données pour MG1655 (EQ353), qui a augmenté à des taux similaires (0,69/h par rapport à 0,75/h pour REL606) dans les milieux minimaux de glucose. Alors que le nombre de protéines signalées était similaire, les abondances de protéines observées ont montré une dispersion considérablement plus importante par rapport aux autres études (S14C, symboles gris dans S14D).

Il convient de noter que les résultats biologiques discutés dans ces études étaient largement insensibles aux problèmes des protéines peu abondantes, car ils étaient basés principalement sur le comportement de groupes de protéines ou sur des protéines individuelles très abondantes. Cela peut être plus clairement vu dans l'étude de Hui et Al ( 2015 ), dans laquelle les abondances de protéines individuelles n'étaient même pas signalées (Hui et Al, 2015). Les autres études ont rapporté des abondances principalement au niveau des voies ou des groupes fonctionnels, qui sont dominés par les protéines abondantes. Rarement les abondances de protéines individuelles sont discutées. En revanche, la quantification robuste des fractions massiques de protéines dans les conditions offertes par notre flux de travail nous a conduit à de nombreux scénarios biologiques intéressants, comme résumé ci-dessous.

Les résultats biologiques analysés dans ce travail sont divisés en deux parties, au niveau des gros grains et au niveau des protéines individuelles. S'appuyant sur des travaux antérieurs (Hui et Al, 2015 ), nous avons d'abord analysé le protéome de E. coli à un niveau grossier, en réponse à trois grands types de conditions limitant la croissance (limitation métabolique et inhibition antibiotique, 29 échantillons au total). Cela a abouti à la classification de 1 821 protéines en huit « secteurs protéomiques », chacun étant constitué de protéines présentant des profils de réponse similaires dans ces conditions. Nos résultats sont tout à fait en accord avec ceux de Hui et Al ( 2015 ) pour les protéines détectées dans les deux études. Cependant, avec notre flux de travail, une résolution beaucoup plus élevée sur les protéines peu abondantes a été obtenue, c'est-à-dire que nous avons quantifié et classé presque deux fois plus de protéines, bien que les fractions massiques absolues de ces protéines ne s'élevaient qu'à

10% de plus que ceux rapportés à Hui et Al (2015). Un grand nombre des protéines nouvellement détectées étaient régulées à la hausse dans les trois limitations (secteur S'), un schéma qui n'avait pas été observé auparavant.Comme bon nombre de ces protéines sont associées à des processus cellulaires tels que la biosynthèse des lipides et de la paroi cellulaire, la division cellulaire, le cycle cellulaire et la réplication de l'ADN, nous avons attribué l'augmentation de la fraction massique de ces protéines à croissance lente à des changements dans le rapport surface cellulaire et nombre de cellules au volume de cellules, car le volume de cellules diminue à croissance lente (Si et Al, 2017). Cela pourrait être montré explicitement pour les porines de la membrane externe (Fig 5E), où l'abondance par masse a augmenté à une croissance lente, correspondant aux profils du secteur S/S', tandis que la densité de surface a montré une constance approximative dans toutes les conditions.

Dans cette étude, nous avons étudié une variété sans précédent de conditions de croissance, ce qui nous a permis de générer un E. coli bibliothèque spectrale et nous a fourni une perspective unique pour étudier E. coli physiologie. Nous récapitulons ici quelques faits saillants. Par exemple, les protéomes des cellules en croissance limitée par le glucose via l'absorption de glucose titrable pourraient être comparés à ceux des cellules se développant sur une variété de sources de carbone. Cela a donné une perspective unique sur l'allocation des protéines dans une croissance limitée en carbone (Fig 6). Étonnamment, seule une petite fraction des protéines régulées à la hausse dans une croissance limitée en carbone étaient spécifiques à l'utilisation des sources de carbone fournies. La moitié de ces protéines régulées à la hausse étaient des enzymes TCA et des protéines apparentées aux flagelles, tandis que le reste était réparti entre d'autres transporteurs génériques et la porine de la membrane externe NmpC. Ce résultat remet fortement en question l'idée que la composition du protéome est allouée de manière optimale pour maximiser la croissance (O'Brien et Al, 2013 de Groot et Al, 2020 Dourado & Lercher, 2020), car bon nombre de ces protéines régulées à la hausse ne sont pas directement utiles pour la croissance de la source de carbone fournie.

Le protéome des cellules soumises à diverses limitations nutritionnelles et inhibition antibiotique a montré de fortes différences telles que quantifiées dans l'analyse sectorielle (Fig 4) et également à partir des diagrammes de dispersion directs (Annexe Fig S10). Étonnamment dans des conditions de stress, en particulier à haute température (42°C) ou sous stress hyperosmotique (0,6 M NaCl), le protéome n'a pas changé de manière significative au niveau mondial, malgré une différence de 4 fois dans les taux de croissance par rapport aux conditions non stressées ou entre différentes conditions de contrainte (Fig 8, Annexe Fig S11). Cela suggère que, contrairement aux limitations métaboliques et à l'inhibition des antibiotiques où le taux de croissance est intimement lié à la contrainte dans le protéome (You et Al, 2013), les défauts de croissance associés à ces réponses au stress ne sont probablement pas dus à une contrainte dans le protéome, mais peuvent plutôt provenir de problèmes qui ne peuvent pas être résolus en réaffectant le protéome.

Une autre découverte surprenante de notre ensemble de données est les différences distinctes sur les fractions massiques de protéines résultant d'effets apparemment mineurs. Par exemple, M9 et MOPS sont deux milieux de croissance couramment utilisés pour les études en laboratoire de E. coli. Cependant, la comparaison de leurs protéomes montre une variété de différences claires causées par des différences dans la disponibilité de la thiamine et du fer (Fig 7A). De même, différentes souches de laboratoire de E. coli, même ceux marqués comme la souche commune MG1655, présentent des différences biologiques importantes (Fig 9), en particulier concernant l'expression des gènes impliqués dans la synthèse et la dégradation du cyclique-di-GMP, une importante molécule messagère dirigeant la formation de biofilm (Jenal et Al, 2017). Ceci est attribué à l'expression dépendante de la souche de FlhDC (Barker et Al, 2004 Fahrner & Berg, 2015 ), le maître régulateur de la synthèse des flagelles, qui pilote également l'expression de PdeH (Ko & Park, 2000 ), la principale phosphodiestérase responsable de la dégradation cyclique du di-GMP. Cette découverte souligne l'importance de la sélection des souches dans l'étude de la motilité et de la formation de biofilm.

Jusqu'à présent, nos analyses ne couvraient qu'une petite partie des protéines quantifiées avec précision dans cette étude. En perspective, nos données peuvent constituer une ressource riche pour la communauté de la biologie des systèmes, afin d'effectuer des tests d'hypothèse, l'intégration avec d'autres ressources omiques quantitatives ou des études biochimiques classiques, ainsi que la modélisation à l'échelle du génome de E. coli expression des gènes et métabolisme. Par exemple, lorsqu'elles sont combinées avec des données RNA-seq sur les mêmes souches et conditions, ces données peuvent être utilisées pour déduire l'efficacité traductionnelle de milliers de gènes dans de nombreuses conditions. Nous nous attendons à ce que des données de cette haute qualité et robustes au niveau des protéines individuelles, annoncent une nouvelle ère dans la biologie quantitative des systèmes.


9E : Analyse du contrôle métabolique et biologie des systèmes - Biologie

Métabolomique : sujets en biologie chimique

Julian L. Griffin, Helen J. Atherton et Michael R. Pears, Département de biochimie, Tennis Court Road, Cambridge, Royaume-Uni

Avec le développement de la biologie des systèmes, plusieurs approches ont été développées pour profiler un niveau d'organisation dans une cellule, un tissu ou un organisme à l'échelle mondiale. La métabolomique, également appelée métabonomie, est une approche qui tente de profiler tous les métabolites à petites molécules dans une matrice biologique. Un défi majeur de cette approche, comme avec d'autres technologies "-omiques", est que le métabolome dépend du contexte et varie avec le stade/l'âge de développement, la modification génétique, la maladie et l'environnement. Ainsi, par définition, le métabolome d'un organisme doit prendre en considération tous les effets de ces manipulations. Malgré ces défis, l'approche a déjà été appliquée pour comprendre le métabolisme dans une gamme de modèles animaux et a plus récemment commencé à être appliquée aux études cliniques. Dans cet article, nous discuterons de certaines approches courantes actuellement utilisées en métabolomique et des résultats qu'elles ont produits. En particulier, nous nous concentrerons sur les deux approches analytiques les plus courantes, la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et la spectrométrie de masse, et sur certains problèmes biologiques qu'elles ont été utilisées pour résoudre.

L'ère postgénomique cherche à définir la fonction biologique des gènes et comment ceux-ci se traduisent pour définir le phénotype d'un organisme. Contrairement aux projets de séquençage du génome, l'étude efficace de la génomique fonctionnelle nécessite une pléthore de techniques multidisciplinaires (1). Le développement d'outils analytiques permettant la mesure à haut débit des produits géniques a fourni une signature complète de l'état physiologique de la cellule à plusieurs niveaux (Fig. 1). La métabolomique décrit l'analyse à grande échelle des métabolites endogènes qui comprennent l'ensemble des petites molécules dans une cellule, un tissu, un organisme ou un biofluide, et comprend les sucres, les acides organiques, les acides aminés et les nucléotides (2, 3).

Figure 1. L'état physiologique de la cellule est mesuré à plusieurs niveaux dans une approche génomique fonctionnelle, qui interagissent tous les uns avec les autres pour former un réseau hautement interconnecté. En particulier, les différences dans le transcriptome, le protéome et le métabolome sont surveillées comme moyen d'étudier la fonction des gènes et les réponses cellulaires aux stimuli externes.

Avantages d'une approche métabolomique

Une approche métabolomique présente plusieurs avantages pour une utilisation en génomique fonctionnelle. Premièrement, comme pour les analyses transcriptionnelles et protéomiques, la technique est dépendante du contexte, de sorte que le complément métabolite varie en fonction de l'état physiologique, développemental ou pathologique de la cellule, du tissu, de l'organe ou de l'organisme, ce qui en fait un outil très puissant. pour mesurer les changements de phénotype.

Deuxièmement, l'importance des métabolites dans le contrôle biologique et la communication, en tant qu'éléments constitutifs de macromolécules complexes et de transporteurs d'énergie, en fait des marqueurs efficaces de la fonction cellulaire. En effet, les métabolites constituent des critères moléculaires plus loin du gène à la fonction. Troisièmement, l'analyse du contrôle métabolique suggère que, même si les changements dans les quantités d'enzymes individuelles devraient exercer peu d'influence sur les flux métaboliques, ils peuvent avoir et ont un impact significatif sur les concentrations de métabolites, même lorsque les changements de flux sont négligeables. Quatrièmement, les métabolites traversent la barrière des espèces car ils ont la même structure chimique quel que soit l'organisme. La métabolomique est donc une technologie « omique » universelle contrairement à la transcriptomique et à la protéomique dans laquelle une connaissance a priori des séquences d'ADN et de protéines de chaque organisme est requise. Peu de temps est nécessaire pour réoptimiser les protocoles pour une nouvelle espèce. Enfin, la métabolomique présente plusieurs avantages pratiques, notamment un faible coût par échantillon, un débit élevé et une automatisation complète. Par exemple, après l'achat initial d'un spectromètre à résonance magnétique nucléaire (RMN) ou d'un spectromètre de masse (MS), les échantillons peuvent être analysés à un coût de l'ordre de £

1,00 par échantillon, en termes de consommables, avec des temps d'acquisition analytique allant généralement de 10 min (RMN) à 70 min (GC-MS). Ce coût se compare très favorablement aux analyses transcriptionnelles et protéomiques.

Les termes métabolomique (2) et le terme connexe métabonomique (3) ont été inventés à la fin des années 1990 pour décrire l'utilisation d'outils de profilage global combinés à la reconnaissance de formes pour définir un phénotype métabolique d'une cellule, d'un tissu ou d'un organisme. La confusion sur ce qu'il faut appeler le domaine est toujours un problème persistant, et les nouveaux chercheurs dans le domaine doivent être conscients des deux termes. De nombreuses personnes utilisent les termes métabolomique et métabonomique de manière interchangeable (4, 5). Cependant, Nicholson et ses collaborateurs déclarent que la métabonomie est la « mesure quantitative de la réponse métabolique multiparamétrique liée au temps des systèmes vivants aux stimuli physiopathologiques ou à la modification génétique », tandis que la métabolomique est la « mesure des concentrations et des flux de métabolites et de la sécrétion dans les cellules et les tissus dans qu'il existe un lien direct entre l'activité génétique, l'activité protéique et l'activité métabolique elle-même » (6). Pour ajouter plus de confusion, des termes supplémentaires ont été proposés en fonction des techniques analytiques adoptées. Le « profilage métabolique » a été proposé pour désigner l'analyse détaillée des métabolites par des techniques de trait d'union telles que la chromatographie en phase gazeuse-(GC)-MS et la chromatographie liquide-(LC)-MS. En revanche, on pense que « l'empreinte métabolique » mesure un sous-ensemble de métabolites et utilise des techniques telles que la RMN et l'électrospray-MS par perfusion directe pour créer un code-barres du métabolisme (7). Le terme «métabolomique» sera utilisé dans cet article tout au long.

Techniques d'analyse

La métabolomique est contestée par l'hétérogénéité et la complexité remarquables des métabolites. Les métabolites couvrent des plages de concentration de l'ordre 10 9 , des plages de polarité de

10 20 , et des gammes de masse de l'ordre de 1500 amu. De plus, la plupart des procédures d'extraction ne fournissent pas de représentations complètes, ce qui entraîne l'analyse d'une partie seulement du métabolome. Une couverture vraiment complète du métabolome nécessite donc de multiples techniques et différentes stratégies de préparation d'échantillons pour englober une telle diversité. Les principales plates-formes analytiques pour la métabolomique comprennent la spectroscopie RMN 1 H et la GC et la LC-MS (Fig. 2), bien que d'autres aient également utilisé d'autres techniques, notamment la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, la chromatographie sur couche mince, la chromatographie liquide à haute pression et la spectroscopie Raman. . Les principales techniques, à en juger par le nombre actuel de publications, seront discutées ci-dessous.

Figure 2. Les deux approches les plus fréquemment utilisées pour la métabolomique sont la spectroscopie RMN et la spectrométrie de masse. Pour maximiser la couverture du métabolome, ces techniques peuvent être combinées. Cette figure montre l'analyse de la fraction aqueuse d'une section de tissu cardiaque qui utilise la spectroscopie RMN, la spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse par chromatographie liquide. Bien que les approches de spectrométrie de masse soient intrinsèquement plus sensibles que la spectroscopie RMN, l'identification des métabolites devient plus difficile.

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) 1 H haute résolution est une technique relativement rapide et très robuste en termes de reproductibilité des résultats. L'ubiquité des protons dans les métabolites cellulaires et le fait que d'autres noyaux sont observables par RMN (par exemple, 31 P et 13 C) signifient qu'un nombre relativement important de métabolites différents peut être détecté. De plus, la technique nécessite une préparation d'échantillon minimale et sa nature non destructive permet de réaliser davantage d'analyses. Cependant, la RMN 1 H est un outil analytique intrinsèquement insensible qui ne mesure que les métabolites à haute concentration. En règle générale, en utilisant une simple séquence d'impulsions unidimensionnelle, la RMN 1 H peut mesurer 30 à 100 métabolites dans l'urine, 20 à 30 métabolites dans le plasma sanguin et 10 à 30 métabolites dans des extraits de tissus (8). Malgré cela, cependant, la RMN 1 H s'est avérée hautement discriminatoire pour les toxines hépatiques chez le rat (9, 10), les modèles murins de maladies cardiaques et neurologiques (11, 12) et les phénotypes silencieux chez la levure (13). Il a été suggéré que cette découverte pourrait être due aux métabolites à forte concentration qui représentent les plaques tournantes centrales du métabolisme, par lesquelles une perturbation à un moment donné d'un réseau métabolique serait transférée à d'autres voies via ces plaques tournantes hautement connectées (14, 15). Cependant, restreindre la couverture du métabolome à une trentaine de métabolites peut entraver l'isolement des métabolites en tant que biomarqueurs uniques des processus pathologiques et confondre la déduction des voies qui sont perturbées lors d'une modification donnée. Des stratégies sont en cours d'élaboration pour faire de la RMN une approche plus sensible, y compris l'utilisation de cryosondes et de techniques de trait d'union. Les cryosondes utilisent de l'hélium liquide pour refroidir l'ensemble bobine RMN et le préamplificateur pour

4 K, qui, en réduisant le bruit thermique, entraîne une multiplication par trois à quatre du rapport signal sur bruit. Les techniques de trait d'union impliquent d'abord de séparer les métabolites à concentration élevée et faible à l'aide de la chromatographie en phase liquide. Cette séparation améliore la sensibilité en réduisant la probabilité de pics de corésons et améliore la plage dynamique de l'expérience RMN (16).

D'autres techniques basées sur la RMN permettent la quantification des concentrations de métabolites dans des tissus intacts, in vivo ou ex vivo. Par exemple, la spectroscopie par résonance magnétique (SRM) permet l'interrogation non invasive des concentrations de métabolites directement in vivo dans une région localisée spécifique. La technique s'est avérée inestimable dans l'investigation de la maladie d'Alzheimer (17, 18), des lésions cérébrales traumatiques (19), de la sclérose en plaques (20) et de nombreuses tumeurs cérébrales (21). Cependant, l'un des inconvénients de la MRS est qu'elle est compromise par une faible résolution spectrale, en partie à cause des champs plus faibles utilisés in vivo, mais également en raison des couplages dipolaires, de l'anisotropie du déplacement chimique et des effets d'inhomogénéité du champ magnétique massif, qui agissent pour élargir le spectre spectral. résonances. Ces effets peuvent être considérablement réduits en faisant tourner l'échantillon à « l'angle magique » (54,7°). En effet, en utilisant la spectroscopie RMN 1 H de rotation à l'angle magique à haute résolution (HRMAS), il est possible de produire des spectres à haute résolution comparables à ceux d'extraits de tissus, en particulier à partir de tissus intacts ex vivo (22-24). Cette méthode contourne le besoin de procédures d'extraction de tissus et élimine efficacement une étape qui introduit plus de variation dans la quantification des métabolites. Un autre avantage de HRMAS 1 H RMN est la perspective d'étudier la compartimentation métabolique. Une étude récente a démontré des sous-compartiments d'acétoacétate et de glutamine dans les mitochondries cardiaques de rat qui n'étaient pas visibles par RMN (22).

La spectrométrie de masse (MS) permet l'analyse de métabolites à plus faible concentration par rapport à la spectroscopie RMN 1H. Cependant, une analyse métabolique complète par MS nécessite souvent un préfractionnement de l'échantillon, les plus courants étant la chromatographie en phase gazeuse (GC) et la chromatographie liquide (LC). Bien que ce préfractionnement améliore la résolution de la technique et réduise la suppression des ions, l'ajout d'une étape chromatographique peut introduire de la variabilité dans un ensemble de données.

En GC-MS, les composés volatils et thermiquement stables sont d'abord séparés par GC et les composés élués détectés par MS. Pour maximiser la gamme de composés volatils et thermiquement stables, les échantillons sont généralement dérivés avant l'analyse pour les expériences métabolomiques. La méthoximation en combinaison avec la triméthylsilylation est le protocole le plus prédominant pour l'examen des métabolites hydrosolubles (25). La méthoximation réduit le nombre d'isomères présents pour les sucres, le nombre de formes isomères étant réduit de 5 à 2, ce qui simplifie considérablement les chromatogrammes. La triméthylsilylation remplace les protons échangeables par des groupes silyle pour rendre les composés moins polaires et donc plus volatils et pour améliorer la chromatographie. Les échantillons dérivés sont vaporisés dans un orifice d'entrée et injectés sur la colonne où ils sont transportés par un gaz inerte. Les composés sont séparés selon leur répartition entre la phase gazeuse mobile et la phase stationnaire liée à la colonne, et les composés élués sont ensuite ionisés dans la source d'ions. La méthode d'ionisation la plus fréquemment utilisée est l'impact électronique dans lequel un faisceau d'électrons ionise les molécules de l'échantillon, qui se fragmentent simultanément. Parce que l'énergie de ces électrons est prédéfinie, le modèle de fragmentation est reproductible et fournit efficacement une empreinte métabolite presque unique. Les métabolites peuvent donc être identifiés facilement en comparant les spectres avec ceux des bases de données de spectre de masse disponibles dans le commerce (par exemple, http://www.nist.gov). Bien que cette approche fonctionne généralement bien, la distinction entre les diastéréomères de sucre est confondue par les deux espèces ayant des modèles de fragmentation identiques. Dans de tels cas, les temps de rétention des normes sont impératifs pour des affectations précises. De plus, les bases de données spectrales ne sont pas exhaustives et tous les pics ne peuvent donc pas être attribués. Actuellement, des efforts sont déployés pour créer des bibliothèques spectrales de masse spécifiques à la métabolomique (26). Une caractérisation plus détaillée des pics inconnus peut être effectuée en analysant les mêmes échantillons en utilisant une ionisation chimique par opposition à une ionisation par impact électronique ou en utilisant des spectromètres de masse à piège à ions. L'ionisation chimique est une méthode d'ionisation moins énergétique et produit donc moins de fragmentation. Cette méthode augmente la probabilité d'observer l'ion moléculaire et peut ainsi faciliter l'identification des composés.

La sensibilité de l'approche GC-MS est impressionnante. À l'aide d'un simple quadripôle GC-MS, Fiehn et ses collègues travaillant sur Arabidopsis thaliana ont signalé la détection de 326 métabolites, un nombre qui a depuis augmenté à plus de 1000 en utilisant un temps de vol GC-MS (25, 27). De plus, la technique a bénéficié des récentes avancées technologiques en GC bidimensionnelle (28).

La LC-MS permet la séparation des métabolites par LC avant détection par MS.La dérivatisation de l'échantillon n'est généralement pas requise car aucune condition préalable à la volatilité n'est nécessaire. De plus, la LC-MS peut analyser une gamme plus large de métabolites par rapport à la GC-MS car elle ne se limite pas aux composés volatils ou aux molécules qui peuvent être rendues volatiles. En particulier, les molécules thermolabiles ou de grande taille telles que les di- et triphosphates, les adduits de CoA, les peptides et les lipides se prêtent toutes à une analyse par LC-MS (29). Après séparation par LC, les composés sont ionisés, typiquement en utilisant une ionisation par électropulvérisation (26). L'échantillon est passé à travers un tube capillaire métallique mince qui contient des ions chargés positivement ou négativement, selon le solvant utilisé. La charge électrostatique de l'échantillon crée alors un nuage de gouttelettes chargées, et la désolvatation de ces gouttelettes produit des ions qui sont échantillonnés par le MS. Étant donné que l'ionisation par électronébulisation provoque une fragmentation minimale de l'ion moléculaire, l'identification directe des métabolites par comparaison des spectres de masse n'est souvent pas possible. Des informations structurelles peuvent cependant être obtenues en utilisant des technologies MS en tandem, grâce auxquelles des fragmentations séquentielles et sélectives peuvent être effectuées. De plus, les composés qui contiennent une fraction fonctionnelle particulière peuvent être analysés en effectuant des expériences de perte neutre.

Pietiläinen et ses collègues (29) ont utilisé la lipidomique basée sur la LC-MS pour examiner si l'obésité acquise était associée à différents profils lipidiques sériques chez de jeunes jumeaux monozygotes adultes concordants ou discordants (différence de poids de 10 à 25 kg) pour l'obésité. Pour les jumeaux discordants, le sérum sanguin présentait des concentrations accrues de lysophosphatidylcholines pro-inflammatoires et proathérogènes et une diminution des éthers phospholipides antioxydants, ce qui suggère que chez ces individus obèses, le profil lipidique était déjà tel qu'il favoriserait l'athérogenèse, l'inflammation et la résistance à l'insuline. La LC-MS a également été utilisée pour suivre les changements dans la fraction aqueuse d'extraits tissulaires (31), de plasma sanguin et d'urine (30) à partir de modèles de rongeurs de diabète de type II, mais ici le plus grand défi consiste à identifier les métabolites détectés, et souvent ces données ont été largement utilisées pour classer des échantillons dans le cadre d'une étude d'empreintes métaboliques plutôt que pour procéder à l'identification de biomarqueurs.

Par rapport à la GC-MS, l'application de la LC-MS dans le domaine de la métabolomique est encore à un stade préliminaire. La reproductibilité est une préoccupation majeure, et la véritable quantification peut être entravée par les effets de suppression d'ions par lesquels un métabolite co-éluant affecte l'ionisation d'un autre (26). Le manque de bibliothèques de spectres de masse à ionisation électrospray rend également l'identification par LC-MS un problème particulièrement difficile. Néanmoins, la technique se développe rapidement et a bénéficié de plusieurs avancées technologiques telles que l'acquisition de données de masse précises par l'utilisation de la transformée de Fourier à résonance cyclotron ionique MS (26).

Il est possible de contourner l'étape de chromatographie et d'utiliser l'infusion directe d'extraits lipidiques dans le spectromètre de masse dans le cadre d'une approche dite « shotgun lipidomique ». Han et ses collègues (32) utilisant cette approche ont démontré une profonde diminution de la cardiolipine dans le myocarde à la suite d'un diabète induit par la streptozotocine, entraînant une accumulation de triglycérides dans le cœur. Des modulations similaires du métabolisme des cardiolipines ont été observées chez la souris ob/ob.

Notez qu'une partie intégrante de l'approche métabolomique est l'application de techniques de reconnaissance de formes pour déduire quelle variation dans un ensemble de données est associée à une maladie donnée, une modification génétique ou une autre manipulation du système. En raison des limitations d'espace, il n'est pas possible de discuter de ce domaine dans le cadre de cet article, mais nous renvoyons le lecteur à plusieurs excellentes critiques (33, 34).

Applications de la métabolomique

La métabolomique s'est avérée extrêmement polyvalente avec une diversité d'applications, notamment l'étude de la fonction des gènes, la toxicologie, le métabolisme des plantes, l'analyse environnementale, les diagnostics cliniques, l'investigation des maladies et la discrimination des génotypes d'organismes. Il n'est pas possible de créer une liste définitive étant donné le grand nombre et la gamme d'approches qui ont maintenant été publiées, mais nous avons présenté ci-dessous quelques publications clés pour démontrer les utilisations potentielles de la métabolomique.

Étude de la fonction des gènes

L'un des premiers succès majeurs de la métabolomique a été la définition de phénotypes silencieux chez la levure où les analyses conventionnelles du taux de croissance n'ont pas réussi à distinguer différents mutants de levure (12). En utilisant la spectroscopie RMN 1 H, il est apparu que les mutants de levure "silencieux" ont des changements compensatoires dans les métabolites intracellulaires pour permettre aux cellules de se développer à un taux normal. Les mutants supprimés pour les gènes d'activité biologique liée ont entraîné des perturbations métaboliques similaires et, par conséquent, des profils métaboliques. Plus précisément dans cette étude, deux souches de levure, supprimées pour l'un ou l'autre des deux gènes redondants pour la 6-phosphofructo-2-kinase, se sont regroupées en fonction de leurs profils métaboliques, tout comme les souches supprimées pour les gènes liés au métabolisme mitochondrial (12) . Les auteurs ont inventé le terme FANCY pour l'analyse fonctionnelle des coréponses chez la levure (12) pour décrire cette approche de métabolomique comparative. Actuellement, FANCY est utilisé pour prédire la fonction des gènes. Les profils métaboliques des souches supprimées pour des gènes connus sont comparés à ceux supprimés pour des gènes inconnus dans l'espoir d'attribuer des rôles biologiques.

Certains des développements les plus importants dans le profilage métabolique, en particulier ceux impliquant la GC-MS, ont été réalisés dans la discipline des sciences végétales (35) (Fig. 3). On pense que les plantes sont exceptionnellement riches en métabolites par rapport aux mammifères et aux levures. Cette richesse provient non seulement de la taille de leurs génomes, qui va de 20 000 à 50 000 gènes, mais aussi de multiples spécificités de substrat pour de nombreuses enzymes, de la compartimentation subcellulaire et des réactions non enzymatiques. Actuellement, 50 000 composés différents ont été élucidés dans les plantes (36), et le nombre final devrait passer à environ 200 000 (28). Parallèlement, les outils et les techniques analytiques utilisés en métabolomique ont été rapidement avancés par les chercheurs dans ce domaine. L'un des principaux objectifs de la métabolomique végétale est d'élargir les informations sur la composition et le contrôle de la biochimie végétale. Le profilage des métabolites a été réalisé sur un large éventail d'espèces végétales, notamment Arabidopsis thaliana (25), la tomate (37), la pomme de terre (38) et le riz (39). Les efforts sont concentrés sur la caractérisation des phénotypes végétaux silencieux et sur la tentative d'élucider les rôles biologiques des gènes de fonction inconnue. Par exemple, une lignée de plants de pomme de terre modifiée supprimée dans l'expression de l'isoforme II de la saccharose synthase n'a présenté aucun phénotype manifeste en termes de morphologie, de rendement ou de taux de croissance par rapport aux lignées parentales. Cependant, en utilisant le GC-time-of-flight-MS pour analyser les profils métaboliques, environ 1000 composés ont été quantifiés et les variétés de plantes ont été discriminées avec succès (38). De même, d'autres chercheurs ont intégré des analyses transcriptomiques et métabolomiques pour étudier les réponses globales au stress nutritionnel chez Arabidopsis thaliana et ont démontré que les gènes et les métabolites impliqués dans le métabolisme des glucosinolates sont régulés de manière coordonnée en réponse à une carence en soufre ou en azote (40). La métabolomique a également été utilisée pour caractériser la synthèse régulatrice de nouveaux produits végétaux, par exemple, des antioxydants modifiés à base de caroténoïdes et de flavonoïdes liés à la santé ont été isolés dans des tomates transgéniques (41). Les interactions plante-hôte sont également une cible populaire pour les études métabolomiques (42, 43).

Figure 3. Un exemple d'utilisation de la GC-MS pour le profilage métabolique. À gauche : une section du chromatogramme d'ions totaux à partir de l'analyse d'extraits de tissus aqueux dérivés de TMS du foie de souris PPAR-α null. Les métabolites sont identifiés à partir des temps de rétention exacts et de la comparaison des spectres de masse correspondants avec ceux de la base de données NIST. 97 métabolites ont été quantifiés. À droite : Résumé des différences de métabolites dans les tissus de la souris PPAR-α null. Rouge - augmenté par rapport au témoin, bleu - diminué par rapport au témoin. L'augmentation/diminution de la largeur de certaines flèches reflète respectivement l'augmentation/la diminution des concentrations relatives dans ces voies.

Sciences de l'environnement

La métabolomique a fait des percées remarquables dans la communauté de la recherche environnementale. Ici, un accent majeur est de comprendre l'impact que le stress environnemental, comme la pollution et le changement climatique, a sur la faune. En effet, de nombreux organismes gouvernementaux surveillent la prévalence des polluants chez certaines espèces fauniques en tant qu'indicateurs du risque d'exposition dans l'environnement. Des études sur le medaka japonais ont été menées pour étudier les effets du trichloréthylène, un polluant environnemental courant, et du pesticide dinoseb, sur le développement des embryons de poisson (44, 45). De même, la toxicité du cadmium a été examinée chez le campagnol des champs et le rat et a révélé des changements dans le métabolisme des lipides qui ont précédé la néphrotoxicité classique (46, 47). Une autre étude a examiné les effets des toxines environnementales sur les vers de terre (48). En particulier, l'analyse d'extraits de tissus de vers de terre par spectroscopie RMN 1 H a identifié le maltose comme un biomarqueur potentiel d'écotoxicité dans un site contaminé par des métaux.

La métabolomique est bien adaptée aux essais cliniques, et à mesure que des outils analytiques plus efficaces et plus complets deviennent disponibles, une multitude d'informations supplémentaires peuvent être recueillies à partir d'essais cliniques coûteux sans augmenter le niveau d'inconfort pour le patient ou diminuer l'aspect pratique pour le médecin. Le fait que toutes les technologies impliquées dans la métabolomique soient à relativement haut débit permet de réaliser des études cliniques à grande échelle. Makinen et ses collègues (49) ont examiné l'utilisation de la spectroscopie RMN 1 H du sérum sanguin pour diagnostiquer la néphropathie diabétique chez 182 personnes atteintes de diabète de type 1. Cette approche reposait, en partie, sur la modélisation des différentes distributions des fractions lipoprotéiques et a produit un test approximativement aussi bon que celui utilisé en clinique. Le groupe a depuis développé une approche de Monte Carlo par chaîne de Markov bayésienne pour modéliser les constituants du profil lipidique saturé dans le sérum sanguin (50) et explore l'utilisation de cette approche pour modéliser les complications associées au diabète de type 1. De même, Brindle et ses collègues ont décrit une méthode basée sur la spectroscopie RMN 1 H pour diagnostiquer potentiellement la maladie coronarienne par le sérum sanguin en remplacement potentiel de l'angiographie (51). Cependant, les ensembles de données peuvent être biaisés pour la stratification d'une population particulière, et donc même dans des études relativement importantes, il faut considérer avec prudence les résultats produits. Kirschenlohr et ses collègues (52) ont démontré que le diagnostic de la coronaropathie par spectroscopie RMN 1 H du plasma sanguin était considérablement compliqué par des changements connexes dans la région lipoprotéine/lipide saturée des spectres RMN 1 H associés au sexe et au traitement par statine et que les modèles précédents avaient produit une classification artificiellement élevée de la présence de la maladie. Roussel et ses collaborateurs (53) ont également démontré que le risque cardiovasculaire était mal prédit par la spectroscopie RMN 1 H et l'analyse multivariée dans une population de diabétiques de type 2. Ainsi, comme dans les études épidémiologiques, il sera important de faire suivre les études de découverte de biomarqueurs métabolomiques chez l'homme avec davantage d'études dans d'autres populations pour détecter les facteurs de confusion potentiels.

Les études discutées se sont largement concentrées sur la métabolomique basée sur la RMN, mais de nombreuses études récentes ont également utilisé la spectrométrie de masse pour quantifier les métabolites à faible concentration de manière ciblée (54) ou pour établir un profil ouvert du chromatogramme (55). Il n'entre pas dans le cadre de cet article de tous les détailler, mais nous renvoyons le lecteur aux revues à la fin de cet article ainsi qu'à une revue par German et ses collègues (56) qui détaille comment ces technologies pourraient être utilisées à des fins cliniques. diagnostic.

La métabolomique est de plus en plus déployée dans les études de toxicologie au sein de l'industrie pharmaceutique, en particulier dans l'évaluation de la sécurité des médicaments candidats. En raison des coûts élevés impliqués dans les essais cliniques, un dépistage précoce efficace de la toxicité est extrêmement souhaitable. La métabolomique vise à identifier de nouveaux biomarqueurs de toxicité et à élucider les mécanismes d'effet (5). Les exemples incluent la corrélation entre des niveaux élevés de créatine dans le sérum et l'urine avec une hépatotoxicité et des effets nutritionnels (9) et la caractérisation de l'acidurie dicarboxylique urinaire résultant d'une altération du métabolisme des acides gras (10). En mesurant les réponses métaboliques du système entier dans l'urine ou le plasma, par opposition aux tests conventionnels qui se concentrent sur des organes sélectionnés, une approche métabolomique peut améliorer notre compréhension des effets toxiques systémiques (5). De plus, la technique peut facilement être incorporée dans les études toxicologiques existantes, et les résultats peuvent être corrélés avec les points finaux mesurés en routine de la chimie clinique et de l'histopathologie.

Enquête sur des modèles animaux de maladies et discrimination des génotypes d'organismes

La métabolomique est idéalement placée comme outil de phénotypage dans l'exploration de modèles de maladies naturelles et transgéniques. Le raffinement des stratégies de knock-out et de knockin combiné à l'accumulation de données de séquence a accéléré la génération de modèles de maladie précis. Par ailleurs, des programmes de mutagénèse chez la souris à grande échelle ont été mis en place, qui ont produit des milliers de mutants à analyser (57). Le dépistage des malformations congénitales et des défauts biochimiques, hématologiques et immunologiques est extrêmement laborieux et chronophage. De plus, de nombreux modèles n'expriment pas le même phénotype que les humains et présentent souvent une pathologie plus légère, de sorte qu'il est difficile d'évaluer les effets d'une perturbation génétique. Cette situation reflète en partie la durée de vie plus courte des organismes modèles tels que les souris par rapport aux humains.

La métabolomique est en train de devenir une aide importante au phénotypage pour caractériser rapidement les tissus et les organismes dans un contexte biologique. Par exemple, à l'aide d'un criblage guidé par la métabolomique de souris mutantes, un modèle de souris présentant un nouveau déficit enzymatique qui ressemble à la maladie du sirop d'érable humain a été isolé (58). Les souris ont été identifiées comme ayant des niveaux élevés d'acides aminés à chaîne ramifiée dans le sang et des concentrations accrues d'acides -céto à chaîne ramifiée dans l'urine. Des recherches plus poussées ont corrélé ces résultats avec un déficit en aminotransférase à chaîne ramifiée. D'autres chercheurs ont utilisé la métabolomique pour caractériser les déficits métaboliques associés à un processus pathologique particulier, par exemple le syndrome métabolique humain. Par exemple, les effets systémiques de la mutation PPARα, un gène important dans la régulation de la réponse alimentée/à jeun, ont récemment été définis en utilisant une combinaison de 1 H RMN et GC-MS, des changements métaboliques ont été suivis dans le cœur, le foie, le squelette muscle et tissu adipeux de la souris PPARα null (31). Des approches similaires de profilage métabolique ont également été menées pour étudier les maladies cardiaques chez la souris mdx (10) et l'athérosclérose chez la souris ApoE3-Leiden (59).

Les techniques métabolomiques ont également été largement utilisées pour phénotyper les troubles neurologiques, avec un large éventail d'applications, notamment la caractérisation de la variation régionale, des tumeurs cérébrales et des troubles neurologiques (60-64) (Fig. 4). Parce que le cerveau est fortement compartimenté, une étude récente a utilisé le profilage métabolique pour caractériser des régions neuroanatomiques distinctes chez le rat ex vivo par rotation à angle magique haute résolution 1 H RMN (62). Des différences biochimiques claires ont été définies entre le tronc cérébral, le cortex frontal, le cervelet et l'hippocampe. Cette étude fournit une référence de base inestimable pour plus d'études spectroscopiques HRMAS 1 H RMN pour surveiller la maladie et les agressions pharmacologiques spécifiques dans le cerveau. De plus, en utilisant la spectroscopie RMN HRMAS 1 H, il a été possible de caractériser une accumulation d'acides gras polyinsaturés dans les gliomes BT4C chez le rat au cours de l'apoptose induite par thérapie génique (61). De tels lipides sont facilement détectables in vivo par spectroscopie de résonance magnétique et pourraient être utilisés pour surveiller l'efficacité de la thérapie génique chez les patients atteints de gliome. En complément de cette étude (65), la composition intermédiaire de bas poids moléculaire des mêmes gliomes de rat a été quantifiée par la suite, et il a été démontré que les concentrations de myo-inositol, de glycine et de taurine étaient corrélées à la densité des cellules tumorales, alors que la concentration globale de les composés contenant de la choline n'étaient pas affectés par la perte cellulaire (66). Une autre étude a combiné la SRM avec des techniques de reconnaissance de formes automatisées pour aider les radiologues à catégoriser les tumeurs cérébrales selon le type et le grade histologiques (66). En utilisant le profilage métabolique, il a été possible de discriminer entre les méningiomes, les astrocytomes de bas grade et les tumeurs agressives telles que les glioblastomes et les métastases. Les profils spectraux préparés à partir de tissus intacts, d'extraits de tissus et de biofluides se sont également avérés hautement discriminatoires pour plusieurs maladies neurologiques, notamment les ataxies spinocérébelleuses et la maladie de Huntington (58, 67).

Figure 4. La spectroscopie RMN 1 H haute résolution a été utilisée pour surveiller les perturbations métaboliques dans un modèle murin de la maladie de Batten appelé CLN3 54. À gauche : spectres RMN 1 H de l'état de solution haute résolution du tissu cortical acquis à 700 MHz. Les spectres typiques du cln3 (rouge) et du tissu témoin (bleu) ainsi que les métabolites assignés sont montrés. À droite : graphique des scores d'un modèle PLS-DA qui compare les tissus de souris cln3 par rapport aux souris témoins. Le modèle a été formé en examinant les spectres d'extraits aqueux de tissu cortical. La mise à l'échelle de Pareto a été utilisée pour mettre les données à l'échelle. Les principaux métabolites responsables de la séparation identifiés à partir de l'examen du graphique de charge correspondant au graphique de score indiqué sont répertoriés sous le graphique.

Bien que l'invention du terme métabolomique ait été relativement nouvelle, une explosion de publications s'est produite dans ce domaine et une prise de conscience que de nombreux chercheurs menaient déjà des études similaires, bien que sans balise « -omique » avant le mot. Il n'a pas été possible de revoir complètement toutes les applications de la métabolomique, et les applications vont augmenter. Outre le développement de nouvelles applications, le développement des approches analytiques occupera également une place centrale alors que les chercheurs repoussent les limites de détection de la spectroscopie RMN, de la spectrométrie de masse et d'autres approches analytiques. En plus de ces développements en « laboratoire humide », les approches de reconnaissance de formes utilisées pour traiter la métabolomique et les bases de données métabolomiques utilisées pour identifier les métabolites doivent être développées ou étendues. À cet égard, les bases de données métabolomiques actuelles trouvées sur le Web qui rendent les spectres standard disponibles gratuitement sont un excellent point de départ pour le voyage ardu vers la découverte de biomarqueurs par le biais de la métabolomique (68-70).

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Introduction

La maladie d'Alzheimer à début tardif (LOAD) est une maladie complexe avec une période prodromique d'environ 20 ans 1,2,3. La phase prodromique/préclinique de la MA est associée à un hypométabolisme cérébral du glucose, qui peut être détecté dans les groupes à risque avant le diagnostic de la maladie, et est prédictive de la progression de la maladie 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13 .

L'hypométabolisme cérébral du glucose, le dysfonctionnement mitochondrial et la réduction du débit d'oxygène dans le cerveau sont considérés comme des facteurs de risque primaires pour la CHARGE 14,15,16,17,18. Au niveau cellulaire, le vieillissement est associé à une expression réduite du transporteur de glucose, à une activité d'hexokinase compromise, à une PDH phosphorylée (inactivée) et à des niveaux et activités altérés d'enzymes clés impliquées dans la phosphorylation oxydative 19,20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36 . Au niveau moléculaire, le vieillissement est associé à une régulation négative significative des gènes OXPHOS codés par le noyau 19,37 et à un équilibre perturbé du pool NAD/NADH, AMP/ATP, purine et pyrimidine 38,39.

Au cours de la quarantaine, les femelles subissent un vieillissement à la fois chronologique et endocrinologique. La transition de la périménopause à la ménopause est unique aux femmes et est liée à des déficits du métabolisme cérébral du glucose et à un dysfonctionnement mitochondrial 3,19,40, qui pourraient contribuer au doublement du risque à vie de MA chez les femmes 41,42,43.

Dans des conditions normales, le cerveau utilise le glucose comme principale source de carburant. Dans des conditions de stress, le cerveau peut s'adapter pour utiliser des sources de carburant auxiliaires en réponse à une crise énergétique. Dans des conditions d'accès restreint aux nutriments, des substrats énergétiques auxiliaires tels que les corps lactate et cétonique sont utilisés pour générer de l'ATP 44,45,46,47. Nos recherches antérieures ont démontré que les corps cétoniques dérivés des lipides du cerveau et de la matière blanche sont utilisés comme carburant auxiliaire dans le cerveau féminin vieillissant en réponse aux déficits du métabolisme du glucose 22,33.

Ici, nous décrivons le profil métabolique dynamique à chaque étape du vieillissement chronologique et endocrinologique de la quarantaine (transition ménopausique) dans le cerveau féminin. Compte tenu du rôle central des mitochondries et de la chaîne de transport d'électrons (ETC) dans la bioénergétique cérébrale, nous avons étudié le transcriptome des gènes OXPHOS codés par les mitochondries et le nucléaire, suivi de l'expression des principaux régulateurs métaboliques en amont. Nous avons ensuite détaillé le profil métabolique dynamique dans le cerveau féminin à chaque étape du vieillissement, en utilisant une analyse métabolomique globale et lipidomique, et étayé ces résultats par une analyse transcriptomique. De plus, nous avons caractérisé la relation entre le cerveau et les profils métaboliques et lipidiques périphériques.


9E : Analyse du contrôle métabolique et biologie des systèmes - Biologie

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(Im) Parfaite robustesse et adaptation des réseaux métaboliques soumis à la régulation métabolique et de l'expression des gènes : marier ingénierie du contrôle et analyse du contrôle métabolique

Contexte : L'analyse du contrôle métabolique (ACM) et la théorie de l'offre et de la demande ont conduit à une compréhension appréciable des propriétés systémiques des réseaux métaboliques qui sont exclusivement soumis à la régulation métabolique. La théorie de l'offre et de la demande n'a pas encore pris en compte explicitement la régulation de l'expression des gènes, alors qu'une variante de l'ACM, c'est-à-dire l'analyse de contrôle hiérarchique (AHC), l'a fait. Les analyses existantes basées sur des approches d'ingénierie de contrôle n'ont pas été très explicites quant à savoir si une régulation métabolique ou de l'expression génique serait impliquée, mais ont conçu différentes manières d'organiser la régulation, avec le potentiel de rendre l'adaptation parfaite.

Résultats : Cette étude intègre l'ingénierie de contrôle et l'ACM classique augmentée de la théorie de l'offre et de la demande et de l'AHC. Parce que la régulation de l'expression des gènes implique une intégration temporelle, elle est identifiée comme une instanciation naturelle de la

« contrôle intégral » (ou contrôle quasi intégral) connu en ingénierie de contrôle. Cette étude se concentre ensuite sur la robustesse et l'adaptation aux perturbations des activités de processus dans le réseau, qui pourraient résulter de perturbations environnementales, de mutations ou de bruit lent. Il est cependant montré que ce type de « contrôle intégral » devrait rarement conduire à une « adaptation parfaite » : bien que la régulation de l'expression des gènes augmente la robustesse des concentrations importantes de métabolites, elle les rend rarement infiniment robustes. Pour qu'une adaptation parfaite se produise, les réactions de dégradation des protéines doivent être d'ordre zéro dans la concentration de la protéine, ce qui peut être rare biologiquement pour les cellules en croissance constante.

Conclusions : Un nouveau cadre proposé intégrant les méthodologies d'ingénierie de contrôle et d'analyse de contrôle métabolique et hiérarchique, améliore la compréhension des systèmes biologiques qui sont régulés à la fois métaboliquement et par l'expression des gènes. En particulier, la nouvelle approche permet d'aborder la question de savoir si les réseaux biochimiques intracellulaires qui ont été et sont identifiés par la génomique et la biologie des systèmes, correspondent aux

Des structures de régulation « parfaites » conçues par l'ingénierie de contrôle vis-à-vis des fonctions optimales telles que la robustesse. Dans la mesure où ils ne le sont pas, les analyses suggèrent comment ils pourraient le devenir, ce qui devrait à son tour faciliter la biologie synthétique et l'ingénierie métabolique.

Mots clés :Analyse du contrôle métabolique, Ingénierie du contrôle, Régulation transcriptionnelle, Biologie synthétique, Robustesse

1Le Centre de Manchester pour la biologie intégrative des systèmes, Manchester

Biocentre interdisciplinaire, Université de Manchester, Manchester M1 7DN, Royaume-Uni

4Département de biologie synthétique des systèmes et organisation nucléaire,

Swammerdam Institute for Life Sciences, Université d'Amsterdam, Science Park 904, NL-1098 XH Amsterdam, Pays-Bas

La liste complète des informations sur l'auteur est disponible à la fin de l'article

Avec le développement d'approches de génomique fonctionnelle quantitative, il est devenu possible d'analyser expérimentalement l'adaptation cellulaire de la physiologie cellulaire à des conditions environnementales modifiées, en surveillant les changements de flux, de métabolites, de protéines ou d'ARNm. De telles adaptations ont tendance à se produire à plusieurs niveaux de régulation sinon simultanément, puis par la suite, selon les échelles de temps d'observation [1-3]. En principe, un changement adaptatif du taux d'une enzyme (ou flux) peut être médié par des changements dans (i) la concentration de métabolites (par exemple substrats, produits et effecteurs) avec des effets directs, coopératifs et allostériques sur l'activité de l'enzyme [4], (ii) des changements dans la concentration de l'enzyme par des modifications de l'expression génique, et (iii) une modification covalente via une transduction du signal. La première est appelée régulation métabolique (ou enzymatique). La seconde est connue sous le nom de régulation de l'expression des gènes (à médiation) et la troisième comme régulation de la transduction du signal (à médiation). En raison de propriétés similaires, ces deux derniers types de régulation ont été considérés ensemble sous le terme de « régulation hiérarchique »[2,5,6]. Bien que dans cet article seuls les deux premiers types de changements adaptatifs soient discutés explicitement, en raison des similitudes mentionnées ci-dessus, le troisième type est abordé implicitement. Jusqu'à présent, des progrès significatifs ont été réalisés dans la modélisation des réseaux métaboliques à l'échelle du génome chez les micro-organismes intégrant la régulation métabolique et de l'expression des gènes [7,8]. Les propriétés à l'état d'équilibre d'un certain nombre de mécanismes de régulation métabolique représentatifs, tels que l'inhibition du produit final, ont été étudiées de manière substantielle à la fois en termes d'analyse du contrôle métabolique (AMC) [9,10] et par la théorie de l'offre et de la demande défendue. par Hofmeyr et Cornish-Bowden [11-13]. Afin de prendre en compte la régulation de l'expression des gènes, l'analyse de contrôle hiérarchique (AHC) [14,15] a été développée comme une extension de l'AMC, mais elle n'a pas encore été liée à la théorie de l'offre-demande. Développer un tel lien semblerait utile car dans des études expérimentales quantitatives, la régulation de l'expression des gènes s'est avérée aussi importante que la régulation métabolique [1,2,5,16].

Les changements adaptatifs des taux de réaction par le biais de la régulation métabolique et génétique sont généralement dus à des mécanismes de rétroaction et/ou d'anticipation. En biologie, il existe une perception selon laquelle l'optimisation évolutive a rendu ces mécanismes parfaits. Si tel était le cas, cela suggérerait que de tels mécanismes pourraient être identiques aux mécanismes de régulation «parfaits» conçus par l'ingénierie de contrôle [17]. En effet, Csete et Doyle [18] ont suggéré qu'une telle évolution convergente de l'ingénierie et de la biologie pourrait s'être produite. En particulier, ils sont venus avec une structure de contrôle intégrale contenant à la fois une unité d'actionnement (correspondant à un intégrateur) et une unité de contrôleur/capteur. Ils ont montré que cette structure de régulation conduirait à un phénomène appelé adaptation parfaite

et a ensuite proposé que de telles structures soient communes à la biologie. Dans des contextes de biologie des systèmes, plusieurs processus biochimiques ont été discutés en termes de structures de leurs systèmes de contrôle. Par exemple, des adaptations parfaites robustes dans le système de signalisation de la chimiotaxie bactérienne, dans l'homéostasie du fer et du calcium chez les mammifères, et dans l'osmorégulation de la levure, ont été interprétées comme des systèmes de contrôle de rétroaction intégrale [19-22], sans toutefois prouver qu'elles correspondaient précisément à la même topologie de régulation ou même performances. Une étude récente a identifié les trois différents types de structures de contrôle utilisées en ingénierie de contrôle, à savoir le contrôle proportionnel, intégral et dérivé, dans la régulation du métabolisme énergétique [23]. À l'exception de [22], les travaux ci-dessus se sont concentrés uniquement sur la régulation métabolique, alors que [22] n'a pas comparé la régulation métabolique à la régulation de l'expression génique. Dans cette étude, l'intégration de la régulation métabolique et de l'expression des gènes ainsi que l'intégration entre l'analyse du contrôle métabolique et l'ingénierie de contrôle seront étudiées.

L'ingénierie de contrôle a examiné quelles structures de réseau peuvent rendre l'adaptation d'un réseau sur une perturbation soutenue d'un composant de réseau, « parfaite ». La perfection a été définie comme le phénomène selon lequel certaines variables importantes du système (appelées "variables contrôlées") devraient être complètement robustes aux perturbations, c'est-à-dire avec des valeurs d'état stable non affectées par les perturbations. Une telle robustesse parfaite peut être obtenue lorsqu'un intégrateur temporel est appliqué à toute variation de la variable contrôlée (ou erreur système). Cette fonction de contrôle est connue sous le nom de « contrôle intégral ». Pendant ce temps intégral, le réseau continuerait à changer jusqu'à ce que la variable contrôlée soit complètement restaurée à sa valeur initiale. Puisqu'il doit y avoir une certaine compensation pour la per-turbation, une variable système différente doit alors s'éloigner de son état initial. Cette "variable manipulée" est non robuste (fragile) à la perturbation, mais permet à la variable contrôlée d'être robuste.

Si l'action de commande est proportionnelle à la variation de la variable perturbée elle-même, ou à une fonction de celle-ci qui est nulle lorsque cette variation est égale à zéro, l'écart ultime de la variable commandée par rapport à sa valeur avant la perturbation sera non nul. C'est ce qu'on appelle le « contrôle proportionnel » de l'ingénierie de contrôle. Les perturbations peuvent également entraîner une oscillation soutenue de la variable contrôlée et pour éviter que cela ne se produise, le troisième type de contrôle axé sur l'ingénierie de contrôle peut être utile, c'est-à-dire le «contrôle dérivé», qui ne sera pas discuté dans cet article, mais a été illustré dans la référence [23].

la même phrase d'adaptation parfaite. Un de ces cas est que toutes les étapes d'une voie métabolique sont régulées de manière identique, c'est-à-dire que leurs activités sont modulées par le même facteur. Tyson et al. [24] ont qualifié cela d'adaptation parfaite, mais le mécanisme repose sur une régulation précise de différentes étapes, nous suggérons de l'appeler

« régulation parfaite », car la partie adaptation n'est pas cruciale. Kacser et Acerenza [25] ont appelé cela la méthode universelle pour l'ingénierie métabolique. Fell et Thomas [26] ont proposé que cela puisse être un motif commun dans la régulation biologique et Adamczyk et al. [27] l'ont élaboré dans le principe d'ingénierie furtive. Cet article ne discutera pas de ce mécanisme de régulation parfait, mais se concentrera sur le mécanisme d'adaptation parfait robuste fonctionnant à travers des boucles de contrôle intégrales.

Dans ce travail, nous essaierons de faire le pont entre deux approches peu connectées dans l'analyse de la régulation des propriétés des réseaux. L'une est celle de l'automatique qui a conçu des structures de réseaux conduisant à une adaptation parfaite ou imparfaite. L'autre est celui de la biochimie avec l'ACM et la théorie de l'offre et de la demande, ainsi que des exemples réalistes de réseaux biochimiques intracellulaires impliquant à la fois le métabolisme et l'expression des gènes. Nous nous concentrerons sur les voies synthétisant des précurseurs pour la synthèse de macromolécules (protéines, acides nucléiques) dans lesquelles ce précurseur inhibe souvent une enzyme tôt dans la voie, à la fois directement et par l'expression de gènes. De telles structures réglementaires du produit final permettent certaines simplifications [28]. Cela les rend aptes à illustrer nos conclusions relativement simples mais valables de manière plus générale. Nous émettrons l'hypothèse que parce qu'une intégration temporelle de la synthèse protéique est impliquée, la régulation de l'expression génique devrait être un excellent exemple de contrôle intégral, tandis que la régulation métabolique est notre candidat pour le rôle de contrôle proporrégulationnel. Nous interpréterons ensuite à la fois ces propriétés de robustesse en régime permanent et les propriétés de contrôle en termes d'un nouveau cadre hiérarchique offre-demande.

Description cinétique et analyse de contrôle classique

Dans cette section, nous démontrons que l'état d'équilibre unique d'un réseau métabolique sous réglementation peut être analysé à la fois par l'analyse basée sur la cinétique et par l'analyse de contrôle métabolique (ou hiérarchique). Une théorie hiérarchique de l'offre et de la demande reliant l'analyse de contrôle hiérarchique à l'analyse classique de l'offre et de la demande est développée lorsque la régulation de l'expression des gènes est active. En conséquence, les propriétés à l'état stationnaire d'un réseau métabolique soumis à divers mécanismes de régulation peuvent être analysées dans un cadre théorique unifié.

Architecture réglementaire de base et analyse cinétique

Le comportement régulateur global d'une voie peut être décomposé en un certain nombre de structures élémentaires.

Une inhibition de la rétroaction par le produit final a été rapportée pour de nombreuses voies métaboliques, en particulier dans l'anabolisme [29]. Un autre motif régulateur est l'activation anticipatrice d'enzymes en aval (voir Annexe A et [30]). De plus, dans de nombreuses voies métaboliques, une ou quelques réactions sont insensibles au produit. Les réactions catalysées par l'hexokinase, la phosphofructokinase et la pyruvate kinase dans la glycolyse des mammifères [31] et plusieurs étapes du métabolisme central du carbone chez B. subtilis [28] en constituent des exemples. Les activités et les concentrations de certaines de ces enzymes sont régulées par des effecteurs allostériques, une modification covalente ou une transcription. Dans cette étude, nous prenons une voie linéaire avec la régulation métabolique et de l'expression génique de la première réaction via le métabolite final comme exemple de choix [28] (Figure 1). La première réaction (catalysée par l'enzyme E1) est supposée insensible à

son produit immédiat. Avec cet exemple, nous pourrons illustrer l'essence des principes que nous recherchons.

Les équations différentielles suivantes décrivent cette voie de régulation du produit final :

x2ð Þ t E1ð Þt ⋅f1ðx1ð Þt xnð Þt p tð ÞÞ−E2ð Þt ⋅f2ðx2ð Þt x3ð Þt Þ

x3ð Þ ¼t E2ð Þt ⋅f2ðx2ð t x3ð Þt Þ−E3ð Þt ⋅f3ðx3ð Þt x4ð Þt Þ

xnð Þ ¼t En−1ð Þt ⋅fn−1ðxn−1ð Þt xnð Þt Þ−Enð Þt ⋅fnðxnð Þt Þ

E1ð Þ ¼t g xnð ð Þt Þ−kED⋅E1ð t

Ici, nous supposons que la concentration du substrat x1 n'est pas influencée par la voie et que seulement

E1 est régulé par l'expression des gènes. xi est le

concentration ofithmetabolite, et décrit la cinétique

de leur réaction. Le paramètrep correspond à d'autres facteurs qui pourraient affecter l'activité de la première enzyme, par ex. cofacteurs ou modulateurs métaboliques externes. De tels effets sur d'autres enzymes ne sont pas abordés ici. La fonction d'expression du gène est ici supposée dépendre du seul métabolite ultime, ce dernier agissant sur la synthèse de la première enzyme. Des situations plus réalistes impliquant la dynamique de l'ARNm seront discutées dans des sections ultérieures. Cet article est pertinent pour la régulation de l'expression des gènes en général, c'est-à-dire qu'il inclut la régulation au niveau de la transcription, de la traduction et de la modification post-traductionnelle, mais nos exemples traiteront principalement d'un seul type de ceux-ci à la fois et considèrent principalement la régulation de la transcription. kED est la constante de vitesse de dégradation du

première enzyme. Dans les organismes à croissance rapide et pour les protéines stables, la kED peut simplement représenter l'effet de dilution

due à la croissance et à la division cellulaires (c'est-à-dire kED=μ, μ désignant

le taux de croissance spécifique) [5,28], mais dans d'autres cas, cela dépendra de la protéolyse, qui sera discutée plus tard.

Par définition de l'état d'équilibre dans les cellules vivantes [32],x1(t)

constantes et égales à E2…Respectivement. En conséquence, s'il existe un tel régime constant en régime permanent, il s'agit de l'unique solution de l'équation suivante :

qui ne dépend que de la première et des caractéristiques enzymatiques finales et est uniquement fonction de la concentration du produit final xn. Habituellement, f1ðx1xnpÞ et g(xn) sont

fonctions décroissantes monotones de xn, qui

décrire la régulation négative, métabolique et de l'expression génique, respectivement. De même, fn(xn) est généralement un

fonction croissante monotone de xn. Comme le montre

Équation (2), le régime permanent correspond à l'intersection des deux fonctions, et est unique en raison des caractéristiques monotones off1,fnandg, comme

Alternativement, si theithreaction (i> 1) est insensible au produit mais que la première réaction ne l'est pas, thenf1est redéfini et il

devient également une fonction de x2, tandis que la fonction cinétique

de theithstep ne dépend que dexi. On peut prouver qu'à

en régime permanent, x2 ne dépend alors que des fonctions f2,…,fi

et est indépendant de fi+1,…,fn−1. Cette conclusion est

à la fois théoriquement attrayant et pratique, car les propriétés à l'état d'équilibre d'une voie métabolique autrement complexe peuvent ne dépendre que d'un nombre limité de caractéristiques enzymatiques [33]. Il s'agit d'un cas où la complexité d'une voie est limitée à son flux et les concentrations des métabolites en amont ne sont contrôlées que par les propriétés des enzymes en amont et des gènes correspondants.

Nous allons maintenant examiner comment l'analyse du contrôle métabolique et la théorie de l'offre et de la demande traitent ces types de structures de contrôle métabolique.

Régulation métabolique : l'ACM et la théorie de l'offre et de la demande L'analyse du contrôle métabolique (ACM) a principalement traité des propriétés à l'état d'équilibre de la partie métabolique de la figure 1Le module de produit final avec l'expression des gènes et la régulation métabolique.x1,x2,…,xnrepresent. les concentrations de métabolites dans la voie E1,E2,…sont les concentrations d'enzymes catalysant chaque réaction. A titre d'illustration, seule l'enzyme de la première réaction (E1) est

supposé régulé négativement par l'effet métabolique (allostérique) et la régulation de l'expression des gènes à travers le produit finalxn.

schémas tels que ceux mentionnés dans la sous-section précédente. L'ACM modulaire [34] a divisé les réseaux métaboliques de ce type en modules aux activités relativement autonomes, reliés par des métabolites bien identifiés. Dans la théorie de l'offre et de la demande, Hofmeyr et ses collègues [12,13] ont utilisé une simplification similaire pour démontrer une grande partie de l'essence de la régulation de la fonction cellulaire. Selon ce dernier, la partie métabolique de la voie du produit final de la figure 1 peut être divisée en une voie linéaire en deux étapes avec des blocs d'offre et de demande, comme le montre la figure 3.

Les coefficients de contrôle de la concentration et du flux de l'analyse du contrôle métabolique mesurent le changement à l'état d'équilibre de la concentration d'un métaboliteX et d'un fluxJ, respectivement, en réponse à un changement dans l'activité d'un processus i. Ce changement d'activité peut être effectué en modifiant un paramètrepi (par exemple, la concentration d'un

inhibiteur) qui est spécifique pour stepi :

Le vi est une activité plutôt que la vitesse de réaction i

à l'état stationnaire. Lorsque le paramètre pi est modifié, vi est

n'est pas égal à la variation résultante de la vitesse de réaction à l'état d'équilibre i c'est la variation de cette vitesse uniquement si toutes les autres variables qui affectent cette vitesse sont maintenues constantes. Les coefficients de contrôle de la concentration du système offre-demande susmentionné peuvent alors être définis comme Cxn

s ¼∂lnð Þxn =∂lnvsupply et Cxn¼∂lnð Þxn =∂lnvdemande,

et les coefficients de contrôle de flux, CJs et CJ de la même manière. Ces coefficients de contrôle décrivent le contrôle exercé par une réaction ou une enzyme spécifique sur les variables globales du système ou les flux, tandis que les propriétés régulatrices « locales » des enzymes individuelles sont quantifiées par les coefficients d'élasticité, tels que

xn mesure comment les vitesses de réaction des blocs d'offre et de demande sont influencées par la concentration du produit finalxn.Car les tarifs sont ceux des blocs plutôt

que des enzymes simples, ces élasticités sont appelées « élasticités globales » [32]. Ils peuvent être davantage exprimés en coefficients d'élasticité plus, mais pas tout à fait élémentaires :

xn désigne l'élasticité totale de la première réaction par rapport à xn à travers la régulation métabolique. Les

les coefficients de contrôle de flux en minuscules se réfèrent désormais au contrôle local au sein du module d'alimentation uniquement (s'ils sont vus comme s'ils étaient isolés avec xnfixé). Ils peuvent être obtenus par sommation

et les théorèmes de connectivité comme coefficients de contrôle du module (voir Annexe B). En supposant que la première réaction est insensible au produit, l'élasticité modulaire de l'alimentation en (5) peut être encore simplifiée comme

Dans un tel cas, la première enzyme a le contrôle total du flux (c.

En utilisant les théorèmes de sommation et de connectivité dans l'ACM, les quatre cients de contrôle de concentration et de flux peuvent être exprimés en termes de coefficients d'élasticité (voir l'annexe B). Pour le contrôle de concentration de l'étape d'alimentation et le contrôle de flux de l'étape de demande, cela devient, en utilisant (5) et (7) :

ð8Þ Ces équations montrent que si la première réaction a un contrôle complet du flux au sein du module d'alimentation, le contrôle de la concentration du produit final et du flux à l'état stationnaire ne dépendent fonctionnellement que de deux coefficients d'élasticité, c'est-à-dire ceux qui correspondent à la première et à la dernière réaction. Lorsque le retour est très fort, c'est-à-dire εv1

xn , le contrôle du flux de demande CJ est proche de 1. Le MCA et la simplification offre-demande de celui-ci discutés dans cette section expliquent en partie les propriétés d'état stable du système de régulation complet susmentionné, mais uniquement pour le cas de la régulation métabolique. Lors de l'inclusion de la régulation de l'expression des gènes, une interprétation plus complète peut être obtenue en utilisant l'analyse de contrôle hiérarchique et une nouvelle théorie de l'offre et de la demande hiérarchique comme étudiée dans la sous-section suivante.

Expression génique et régulation métabolique : théorie hiérarchique offre-demande

Westerhoff et ses collaborateurs ont développé l'analyse de contrôle hiérarchique (AHC), une extension de l'ACM qui peut prendre en compte la régulation de l'expression des gènes et la transduction du signal [14,26]. Nous allons ici implémenter cela en étendant la moyenne des coefficients d'élasticité dans la sous-section précédente pour inclure la régulation par les expressions géniques.

Lorsque l'on considère la partie métabolique du réseau seul, c'est-à-dire si l'expression des gènes était toujours la même, le contrôle de la concentration de l'intermédiaireX dans un système offre-ply-demande suit (8). Si les rôles de la synthèse et de la dégradation des enzymes métaboliques sont considérés explicitement, comme illustré à la figure 4, l'AHC doit être introduit, et le coeffi-cient de contrôle hiérarchique correspondant devient :

Capital His utilisé ici pour les coefficients de contrôle hiérarchique tels que définis dans le tableau 1. s

X est un coefficient d'élasticité « global », incluant une « élasticité directe » classique uniquement liée aux réponses métaboliques (c'est-à-dire εs

xn défini dans le MCA en (8)) et une « élasticité indirecte » due à la régulation de l'expression des gènes :

La minuscule cis est utilisée pour les « coefficients de contrôle métabolique », c'est-à-dire les coefficients de contrôle qui ne prennent en compte que le réseau local (métabolique, ou l'expression des gènes mais pas leur combinaison). s

Es est souvent égal à 1, c'est-à-dire lorsque la vitesse de la réaction isolée est proportionnelle à la concentration de l'enzyme la catalysant.

En utilisant l'analyse de contrôle métabolique pour la partie expression génique du réseau, le coefficient de contrôle de la réaction de synthèse protéique par rapport à la concentration de la protéine synthétisée est :

En combinant les expressions ci-dessus, on peut exprimer le coefficient hiérarchique quantifiant le contrôle exercé par l'enzyme d'apport sur la concentration de l'intermédiaire métabolique X en fonction de l'ensemble des coeffi-cients d'élasticité dans le réseau :

ð12Þ Les termes entre parenthèses sont généralement positifs. L'équation montre que le contrôle par l'offre (i) diminue avec les grandeurs absolues des élasticités par rapport à X de l'offre, de la demande et de la synthèse des protéines, mais (ii) augmente pour des élasticités croissantes de la protéine. réactions de synthèse et de dégradation par rapport à la concentration de l'enzyme. L'équation montre également que pour des grandeurs finies non nulles des élasticités, les coefficients de contrôle hiérarchique pour le contrôle par l'offre peuvent être diminués par les élasticités du réseau d'expression génique, mais n'est généralement pas apporté

Figure 4Illustration du contrôle hiérarchique. La partie inférieure représente un apport métaboliquesystème de demande, dans lequel l'offre est catalysée par des enzymesEs (ou des enzymes issues d'un opéron).

La partie supérieure décrit la synthèse du processus enzymeEsin a

jusqu'à zéro. Il en va de même pour le contrôle par la demande, qui est égal à moins le contrôle par l'offre.

Rappelons maintenant le module de produit final avec les rétroactions régulatrices à la fois métaboliques et d'expression génique de la figure 1. Comme le produit final (xn) régule la première réaction

grâce à la fois à la régulation métabolique et à la régulation de l'expression des gènes, l'élasticité « globale » correspondante (voir tableau 1) de la première réaction peut être exprimée comme suit :

xn désigne l'élasticité par la régulation métabolique,cE1

vTrans désigne le contrôle de l'expression des gènes (c'est-à-dire

transcription et traduction) sur la concentration de la première enzyme [15,35]. En remplaçant le v1

xn dans (7) avec l'expression plus complète (13), c'est-à-dire en utilisant εs

xn, le coefficient de contrôle hiérarchique Hxn

s peut être exprimé en coefficients d'élasticité, de la même manière que (12). Étant donné que la régulation métabolique et la régulation de l'expression des gènes constituent des rétroactions négatives, sXm est négatif et devient plus négatif avec l'augmentation de xn en raison de l'augmentation de l'inhibition du produit.

xn est positif et décroît asymptotiquement jusqu'à zéro lorsque xn augmente. Par conséquent, la relation entre

la vitesse de réaction et la concentration du produit final peuvent être décrites en termes d'élasticités comme le montre la figure 5. La figure 5 explique les résultats uniques à l'état d'équilibre obtenus à partir de l'analyse classique à l'état d'équilibre (voir la figure 2).

Une illustration de la relation offre-demande similaire à la figure 5 a été présentée dans [13]. Cependant, nous étendons ici l'interprétation du système et des coefficients d'élasticité correspondants au cas plus général qui inclut la régulation de l'expression des gènes. En tant qu'extension de la théorie classique de l'offre et de la demande, l'analyse présentée dans cette section peut être appelée la théorie de l'offre et de la demande hiérarchique.

La discipline de l'ingénierie de contrôle identifie d'abord une variable dite contrôlée, qu'elle considère comme la sortie du système. En biochimie métabolique, la sortie se rapporte souvent à un flux, mais peut également être la concentration d'un métabolite important dans la voie. L'ingénierie de commande examine ensuite les différentes catégories de mécanismes qui peuvent contribuer à la capacité du réseau du Tableau 1 La liste des symboles et des définitions

Définition des symboles et commentaires

i Les coefficients de contrôle métabolique tels que définis en (3).fis la fonction du système d'intérêt (c'est-à-dire un flux particulier,Jj, ou une concentration de métaboliteX). Les minuscules sont utilisées pour représenter le contrôle au sein d'un réseau local (par exemple, module d'alimentation). L'index désigne le processus qui contrôle.

i Coefficient de contrôle hiérarchique. Sa définition mathématique est de la même forme que les coefficients de contrôle métabolique en (3), mais le système à l'étude peut être plus général. Le MCA n'étudie que le contrôle dans une voie métabolique ou une cascade de transduction de signal, mais pas leur combinaison. HCA étudie le contrôle dans un réseau de régulation hiérarchique avec des interactions à différents niveaux, c'est-à-dire métabolique, transduction du signal et expression génique.

i Coefficient de robustesse basé sur le MCA (ou HCA).

i Coefficient de fragilité. C'est l'inverse du coefficient de robustesse et identique au coefficient de contrôle.Ffi≡∂∂lnlnefi≡

xi Coefficient d'élasticité défini en MCA. Il dénote les influences immédiates de metabolitexiwith en ce qui concerne la vitesse de réaction dans thej

à l'état pré-stationnaire. s

xi Coefficient d'élasticité du métabolitexi par rapport au module de l'offre (s) ou de la demande (d) métabolique, tel que défini en (4).

L'élasticité globale (voir [32]) pour une étape de réaction sous régulation à la fois métabolique et de l'expression génique, ou l'élasticité globale dans un module hiérarchique d'offre ou de demande.

Taux de réaction de transcription ou de traduction

vRDorvED Taux de réaction de la dégradation de l'ARNm ou des protéines

Constante de vitesse de dégradation de l'ARNm ou de la protéine kRDorkED

kiprotéolyse Constante de vitesse de la protéolyse d'ordre μ Vitesse de croissance (division) spécifique des cellules E Concentration de l'enzyme

X ou xi Concentration du métabolite intermédiaire

maintenir la variable contrôlée proche de sa valeur d'état stable d'origine lorsque le système est soumis à une perturbation soutenue. L'« erreur (fonction) » est l'écart (δX) de la valeur de la variable contrôlée (X) par rapport à sa valeur avant la perturbation, ou la différence par rapport à un signal de référence r. Le réseau « s'adapte » à la per-turbation de la variable contrôlée, c'est-à-dire à la fonction d'erreur, dans ce qu'on appelle une « action de contrôle ». L'ARN polymérase plus les ribosomes qui, ensemble, traduisent les changements de concentration des métabolites en changements d'expression génique, ou une régulation métabolique directe de l'activité d'une enzyme correspondent à de telles actions de contrôle. La sortie de l'action de contrôle (ou du « contrôleur ») est souvent appelée la variable manipulée. Dans le métabolisme, les taux de réactionv(X,E) sont des variables manipulées soit par la concentration des métabolites (f(X)) soit par la tion de l'enzyme qui catalyse la concentration de la réaction (E). Un système de commande mécanique comprend souvent un actionneur qui convertit le signal de commande en une sorte de mouvement mécanique. Pour un système biochimique discuté dans cette étude, cela peut correspondre à l'enzyme catalysant la réaction synthétisant ou dégradantX. Habituellement, il existe un capteur qui mesure la variable contrôlée et traduit sa fonction d'erreur dans le signal d'entrée du contrôleur. Dans une régulation de l'expression génique, le facteur de transcription peut être considéré comme le capteur.

Les trois catégories de contrôle les plus utilisées sont les mécanismes de contrôle proportionnel, intégral et dérivé (PID) [17]. Ils diffèrent selon que la réponse du système de commande est fonction de la « fonction d'erreur » elle-même, de son intégrale temporelle ou de sa dérivée temporelle, respectivement. Dans la littérature sur la biologie des systèmes, le mécanisme de contrôle proportionnel

a déjà été évoqué en termes de régulation métabolique [19,20,23] (par exemple rétro-inhibition). Cependant, lorsque Control Engineering discute des mécanismes de contrôle proportionnels, la réponse est proportionnelle à la fonction d'erreur. En biochimie réelle, l'activité enzymatique est rarement une fonction linéaire des concentrations de métabolites X, qui comprend le substrat de l'enzyme, son produit et les modificateurs allostériques. L'ACM s'adapte à cette non-linéarité en permettant au coefficient d'élasticité de différer de 1. La régulation métabolique par la « fonction d'erreur » fait partie de la dynamique non linéaire du processus ou du système, c'est-à-dire f(X), à la fois conceptuellement et dans la modélisation mathématique. Il semblerait donc que le contrôle proportionnel de l'Ingénierie de Contrôle puisse être non linéaire dans les réseaux biochimiques.

Une action de contrôle intégral par l'accumulation de molécules dans le processus métabolique a également été rapportée [19,20,23]. Ici, la réponse du système doit être une fonction non pas de la fonction d'erreur elle-même mais de l'intégrale de cette fonction d'erreur. Dans la présente étude, nous examinons la régulation de l'expression des gènes de ce point de vue, puisque la synthèse des protéines nécessite une intégration temporelle et dépend de la fonction d'erreur, et parce que les changements dans la concentration des protéines affectent directement le taux de réacconcentration de la protéine. peut catalyser. On peut s'attendre à ce que ce contrôle intégral corresponde en quelque sorte aux « élasticités indirectes » de l'AHC. La question de savoir si la régulation de l'expression des gènes correspond effectivement à un mécanisme de contrôle intégral exact (ou idéal) sera discutée plus en détail dans la section Résultats et discussion. S'il existe une action de contrôle dérivée et si elle est liée à un type spécifique de régulation dans une voie métabolique ne sera pas étudiée dans cet article. La référence [23] a déjà identifié un exemple.

Considérant la dynamique d'un système métabolique, nous pouvons écrire la dépendance temporelle des concentrations de ses métabolites comme :

N est la matrice stoechiométrique. E est une matrice diagonale avec les concentrations des enzymes qui catalysent les diverses réactions le long de sa diagonale. f(X) est une fonction vectorielle des concentrations des métabolites et des valeurs des paramètres cinétiques. La voie métabolique régulée peut être décrite en termes de système de contrôle de rétroaction en boucle fermée, comme indiqué à la figure 6, dans lequelkp, ki

et kd sont les paramètres de contrôle PID. Notons ici

que la figure 6 et les figures suivantes s'abstiennent de détail biochimique. C'est parce que l'analyse dans le présent article vise à obtenir un ensemble de conclusions ayant une signification générale. Le fait d'être précis dans les schémas que nous utilisons comme illustrations nuirait à cet objectif.

Lorsque l'on considère une perturbation soutenue γ∙δp (par exemple, un changement dans un paramètre p) et que l'on désigne par δle (petit) écart par rapport à l'état d'équilibre avant cette perturbation, la variation en fonction du temps des concentrations de métabolites peut être observée :

X_ ¼N⋅δv Xð EÞ ¼N⋅Ess⋅f′ð ÞX⋅δXþN⋅f Xð Þss⋅δEþγ⋅δp

L'indice ss fait référence aux valeurs en régime permanent. En substituant l'intégration temporelle de l'expression génique, c'est-à-dire

qð Þτ ⋅dτ, pour δE, et en supposant la proportion

et les actions dérivées faisant partie du processus métabolique (14),

X_¼N⋅Ess⋅f′ð ÞX ⋅δXþN⋅f Xð Þss⋅ki⋅ Z

Ceci décrit la dynamique globale d'un système métabolique en boucle fermée sous perturbation comme une somme de trois termes. Le premier terme de ceux-ci est une fonction non linéaire de (ou au premier ordre proportionnel à) la perturbation de la variable contrôlée (c'est-à-dire la fonction d'erreur)δX. Ce terme décrit toutes les élasticités directes, y compris les cinétiques non régulatrices du système telles que les effets du substrat et du produit, et (autre) la régulation métabolique telle que l'activation allostérique. Le second terme correspond à une intégrale temporelle d'une fonction de la perturba-tion de la variable contrôlée δX, et peut également dépendre d'autres variables du système comme discuté dans la section Résultats et discussion.

Nous allons maintenant examiner si ces deux termes de l'équation (16) correspondent aux boucles de régulation proportionnelle et intégrale de Control Engineering.

Un exemple simple de combinaison métabolique et

régulation de l'expression génique d'un processus intracellulaire important : le métabolisme de l'ATP (énergie)

Considérons l'exemple simple donné sur la figure 7, c'est-à-dire une voie en deux étapes avec l'ATP et l'ADP comme intermédiaires combinés et avec l'expression du gène codant pour la première enzyme E augmentant proportionnellement à la concentration d'ADP. La « somme de conservation de la fraction » C est la somme des concentrations d'ATP et d'ADP et d'une constante ici (c'est-à-dire C = [ATP] + [ADP]) car les réactions ne font que convertir l'une en l'autre. La régulation métabolique traite de l'interaction entre les processus d'offre et de demande (sable).

La dynamique de l'ADP et de l'enzymeE est ici supposée suivre une cinétique d'action de masse :

La dégradation de l'enzyme s'écrit ici comme la somme de deux termes, qui serviront à souligner l'im-plication de cette dégradation pour être indépendante (forkb= 0)

ou dépendant (pour k0= 0 voir ci-dessous) de l'enzyme

concentration. Le taux de dégradation du premier ordre reflète la

l'hypothèse qu'il existe une activité de protéase plutôt non spécifique pour laquelle l'enzyme E particulière que nous considérons ici est un substrat minoritaire. La dégradation d'ordre zéro refléterait un cas où il existe un système de protéase spécifique pour l'enzyme E (par exemple une ubiquitination suivie d'une protéase générique) qui est saturé par la concentration déjà élevée de l'enzyme par rapport au KM de la

ubi-quitine transférase. Dans (17), toutes les constantes de vitesse sont considérées comme non négatives et k0= 0 chaque fois que E est non positif. Les

La structure du système de contrôle en boucle fermée de la voie peut être représentée comme dans la figure 8.

Le schéma du système de contrôle suggère que la concentration en ADP est la variable contrôlée et la concentration en enzyme E une variable manipulée dans la boucle de contrôle de l'expression génique. Le taux de dégradation d'ordre zéro k0 peut être traité comme un signal de référence pour

le système. La régulation métabolique fait partie du processus cinétique de l'ADP. En considérant une perturbation de kd à partir de sa valeur en régime permanent (c'est-à-dire

δkd), et reformuler la cinétique de ADP et E

δ½ADP : ¼−ðks⋅EssþkdÞ⋅δ½ADP−ks⋅½ADPss⋅ Z ∞

ð18Þ En comparant cela à un système de contrôle général en boucle fermée (16), avec ADP forX, nous reconnaissons du côté droit d'abord un terme de réponse proportionnel, puis un terme de réponse intégral, et enfin le terme de perturbation. La réponse proportionnelle correspond à la réponse directe

« élasticité » des réactions d'offre et de demande par rapport à la fonction d'erreurδ[ADP], qui est une régulation métabolique et instantanée. La réponse intégrale est liée à la synthèse et à la dégradation des protéines et donc à la régulation de l'expression des gènes.

Lorsque la dégradation de l'enzyme est d'ordre zéro en termes de E (c'est-à-dire quandkb = 0), la régulation de l'expression des gènes

devient une boucle de contrôle intégrale idéale, et le réseau métabolique peut présenter une adaptation parfaite et robuste aux perturbations externes ou paramétriques. Cela peut être compris en exigeant que (18) soit valide dans un état stable, c'est-à-dire avec des valeurs indépendantes du temps pour [ADP] etE.Comme le temps entier atteint l'infini, cela nécessite que l'argument de l'intégrale, ieka⋅δ [ADP]−kb⋅δE, doit être égal à zéro. Les

Le mécanisme de cette adaptation parfaite est qu'après la per-turbation, la concentration de l'enzyme variera jusqu'à ce qu'elle rende les dépendances temporelles égales à zéro par elle-même, renonçant au processus plus habituel de régulation métabolique qui change dans la variable contrôlée arrange pour la stabilité état à atteindre à nouveau en présence de la perturbation soutenue.

Pour le cas plus général où la dégradation de l'enzyme peut dépendre de la concentration de l'enzyme, le contrôle (hiérarchique) du niveau de l'enzyme par la réaction de demande peut être exprimé en termes de paramètres cinétiques et de concentration d'ADP à l'état d'équilibre (voir Annexe C) :

Le contrôle de flux exercé par la réaction de demande est quantifié par :

Le contrôle du niveau d'enzyme et le contrôle du flux de demande par la perturbation sont égaux à 1 moins une fonction hyperbolique de kb. Pour le scénario de contrôle intégral idéal de kb = 0, la concentration enzymatique E suit l'activité de

la voie dégradant parfaitement l'ATP, c'est-à-dire HE

kd¼1. Plus important encore, le flux de chemin suit parfaitement la perturbation dans le flux de demande et HJk

d 1. C'est le cas de l'adaptation parfaite robuste. Pour les autres cas lorsquekb≠0, le

l'adaptation de la voie à la perturbation ne sera pas parfaite et les deux coefficients de contrôle sont inférieurs à 1.

De plus, le coefficient de robustesse [36] des concentrations d'ADP vis-à-vis des perturbations de la demande-réaction peut être exprimé en termes de constantes cinétiques et de concentration d'ADP (voir le tableau 1 pour la définition) :

Seulement ifkb= 0,kd= 0, ou [ATP]ss=0, l'ADP et l'ATP

sont parfaitement robustes (ℜ½kADP ¼∞) versus perturbations.

La fragilité [36] de la concentration d'ADP vis-à-vis de la per-turbation dans la réaction de demande, qui est l'inverse de la robustesse, peut être quantifiée par le coefficient de contrôle de la concentration de l'ADP vis-à-vis du processus de dégradation . Il se lit comme suit :

Cette fragilité est une fonction hyperbolique de la constante de vitesse de dégradation de premier ordre de l'enzyme et donc nulle lorsque cette dégradation est d'ordre zéro (voir la figure 9 pour l'illustration). La fragilité a pour valeur maximale le rapport ATP/(ADP + ATP) (donc la robustesse minimale est égale au rapport (ADP + ATP)/ATP). La moitié de la fragilité maximale est atteinte pour :

Cela signifie que la fragilité peut être faible pour une amplitude substantielle de la constante de vitesse de premier ordre de dégradation des protéines si la constante de vitesse pour la synthèse des protéines est également élevée. Les coefficients de contrôle pour le niveau enzymatique HE

kd et le flux de demande H J

kd atteint un maximum de 1 et une valeur de ½ lorsque la fragilité de l'ADP est à moitié maximale.

Ces conclusions peuvent être quelque peu généralisées en implémentant directement l'analyse HCA et le résultat hiérarchique offre-demande donné en (12). Pour le modèle ci-dessus, les coefficients d'élasticité prennent les grandeurs suivantes :

ð24Þ Figure 8Structure du système de contrôle du métabolisme énergétique de l'ATP.k0andkbare les constantes de taux de dégradation des protéines d'ordre zéro et de premier ordre.kais

Pour la robustesse de la concentration d'ADP vis-à-vis d'une demande accrue on trouve alors :

Cela montre que la robustesse est infinie si la réaction de dégradation de l'enzyme est d'ordre zéro (c'est-à-dire εb

E¼0), et que la robustesse diminue avec l'ordre croissant (élasticité) de cette réaction.

La conclusion la plus importante ici est qu'il n'y a pas de discontinuité dans la capacité des boucles de contrôle intégral à conduire à une bonne adaptation. Plus la dégradation de l'enzyme qui permet l'adaptation est proche d'une réaction d'ordre zéro, plus son suivi de la perturbation dans le flux de demande est fort, et plus la robustesse de la variable qui doit être maintenue homéostatique est élevée. Le phénomène important est peut-être que la robustesse n'est pas déterminée par l'amplitude de la réaction de dégradation mais par son ordre cinétique (c'est-à-dire l'élasticité du coefficient de Hill effectif). Les conclusions correspondantes concernent le suivi de la demande par le niveau enzymatique E et le contrôle du flux de la voie par la réaction de demande.

Un autre problème en ingénierie de contrôle est la robustesse des systèmes par rapport aux perturbations à différentes fréquences. En ingénierie, une aile d'avion doit être robuste aux variations de pression d'air à hautes fréquences, ainsi qu'à basses fréquences. Afin d'atteindre cette robustesse combinée, différentes boucles de contrôle peuvent devoir être mises en place simultanément, bien qu'un compromis limite ce que l'on peut

faire [18]. En biologie des systèmes, cela peut être illustré pour la régulation par rétroaction du produit final dans la figure 1. Si la demande de flux de la voie augmente rapidement, la concentration du produit final diminue rapidement et en raison de l'effet d'inhibition direct du produit allostérique. , l'activité de la première enzyme augmentera également rapidement. Ce contrôle métabolique de l'activité enzymatique est un actionneur rapide du système. Cependant, s'il y a une nouvelle augmentation de la demande de flux, la première enzyme peut « perdre » sa capacité de contrôle puisque son activité peut approcher de sa capacité maximale (kcat). A ce stade, le système peut alors

subissent une seconde « adaptation » par l'expression des gènes qui devrait être plus lente car la cellule doit produire une enzyme, mais qui finit toujours par entraîner une augmentation de la concentration de la première enzyme. Cette augmentation devrait alors diminuer la stimulation métabolique directe de l'activité catalytique de l'enzyme discutée ci-dessus. En ce sens, la régulation de la première enzyme de la voie est bi-fonctionnelle en termes dynamiques [18] : la régulation métabolique rejette rapidement les perturbations à haute fréquence mais éventuellement avec une faible amplitude ou capacité, tandis que la régulation de l'expression génique est lent à s'adapter, mais peut être capable de rejeter de très grandes perturbations constantes.

Conditions de contrôle intégral et pseudo-intégral : voie du produit final

Dans cette section, nous rappelons l'exemple du module du produit final (dont l'exemple du métabolisme simple de l'ATP est un cas particulier) pour analyser la régulation de l'expression des gènes dans une voie métabolique plus générale. En particulier, seront identifiées les conditions pour lesquelles la régulation de l'expression génique constitue un contrôle intégral idéal ou un contrôle pseudo-intégral seront discutées. Un exemple de produit final simple mais représentatif est donné sur la figure 10, c'est-à-dire une voie linéaire avec trois métabolites, où pour les trois enzymes, l'expression du gène est régulée par le dernier métabolite. Le modèle cinétique de cet exemple avec tous les paramètres est fourni dans [5].

La transcription et la traduction des gènes sont modélisées ici explicitement en incluant davantage la fonction dynamique de l'ARNm comme

E ¼vTrnl−vED¼gTrnlð ÞR −kED⋅E ð

HeregTrnl(R) =kTrnl⋅Ris une fonction de l'ARNm

la concentration R. kED se compose essentiellement de trois parties. Une

terme est dû à la dilution, qui est proportionnelle au taux de croissance cellulaire spécifique μ. Les autres termes correspondent à la protéolyse, comme ci-dessous :

Le terme final désigne la protéolyse d'ordre zéro telle qu'elle serait provoquée par des protéases saturées avec la protéine d'intérêt. Nous supposons ici que le taux de croissance spécifiqueμ est indépendant de l'activité de la filière étudiée, hypothèse parfois mais pas toujours réaliste. Puisqu'après multiplication par E, le dernier terme est indépendant de la concentration en protéine, il est commode de déplacer ce terme dans la fonction de synthèse de protéine gTrnl(R). Ainsi, la nouvelle protéine

le taux de dégradation peut être défini comme,

et la dynamique des protéines peut être réécrite comme,

Dans la phase de croissance exponentielle ou si la protéolyse est de premier ordre (c'est-à-dire kED≠0), l'exemple de voie ci-dessus

correspond à un scénario de contrôle pseudo-intégral ou non intégral. La structure de contrôle du système de régulation est ensuite donnée par la figure 11. La dynamique du « capteur » est ici décomposée en abordant à la fois la transcription et la traduction via l'ARNm. En régime permanent, souvent gTrnl(R)ss=kED⋅Ess≠0. Par conséquent, après

perturb-ation d'un paramètre du système (c'est-à-dire les constantes cinétiques), les nouvelles valeurs à l'état stationnaire de x3, R et gTrnl(R)

ne sont plus les mêmes que les anciennes valeurs à l'état d'équilibre, ce qui indique qu'alors le système de régulation ne réalise pas une adaptation parfaite. Cependant, lorsque kTnD est

un comportement d'adaptation très faible et presque parfait doit être observé.

Un scénario de contrôle intégral idéal ne se produira que lorsque la cellule entre dans une phase stationnaire et qu'il n'existe qu'une protéolyse d'ordre zéro, c'est-à-dire kED¼μþk1protéolyse¼0. Dans

tel cas, en régime permanent, gTrnl(R)ss≡0 dû à l'intégrale

contrôle, et R et x3 garderont également toujours le même

des valeurs constantes à l'état d'équilibre, quelle que soit la façon dont les paramètres du système sont perturbés. L'adaptation du système est alors parfaite dans le sens où les propriétés du système R et x3 sont robustes aux perturbations.

Les fonctions gTrnl(·) et gTrsc(·) peuvent également être

multivarié, c'est-à-dire qu'il contient d'autres variables système. Ce n'est que si ces va-riables ne dépendent pas fonctionnellement de la concentration en protéines (E), que l'adaptation vis-à-vis des perturbations des paramètres cinétiques du système restera parfaite.

Le scénario idéal de contrôle intégral que nous avons envisagé ci-dessus conduit à la parfaite robustesse de certaines variables du système vis-à-vis de certaines perturbations (externes ou paramétriques). Un deuxième aspect du scénario d'adaptation parfaite est le suivi parfait par une deuxième variable système des perturbations. Un suivi parfait signifie que le changement relatif de la variable est identique au changement relatif du paramètre perturbateur. Si le paramètre est l'activité d'un processus, alors cela signifie que le coefficient de contrôle correspondant est égal à 1. Le parfait suivi des références et la parfaite robustesse des variables contrôlées aux perturbations sont deux aspects des systèmes de contrôle intégrés , c'est-à-dire que les deux caractéristiques peuvent être observées simultanément pour le même système. Une voie spécifique montre alors une parfaite robustesse d'un système variable vis-à-vis de multiples perturbations (ou paramètres) mais un suivi parfait par rapport à un ensemble limité de paramètres (par exemple un signaleur de référence).

Figure 10A voie de produit final linéaire avec expression génique et régulation métabolique. Les métabolites sont désignés par xi, l'ARNm par mR et les enzymes par E. S et P sont les métabolites externes. Metabolitex3 inhibe le taux de l'enzyme 1 par le biais de la régulation métabolique et de la

Pour l'exemple ci-dessus, la protéolyse d'ordre zéro peut être considérée comme un signal de référencer¼k0protéolyse. En effet, une perturbation de cette constante de vitesse correspond à une perturbation externe de la synthèse des protéines. L'effet est que même dans un cas de contrôle intégral idéal, c'est-à-dire quandkED= 0,

la concentration d'ARNm à l'état d'équilibre ne deviendra pas 0. Au contraire, il suivra toujours le référenceur (c'est-à-dire R=r/kTrnl≠

0) chaque fois queE_ss¼0. La structure du système de contrôle de suivi de référence est incluse dans la figure 11 avec referencer à laquelle se réfère une flèche en pointillés, et avec gTrnl(R) représentant alors

Préoccupations pratiques et hypothèses sur la constante de vitesse de dégradation kED

En général, kED¼μþk1protéolyse>0 . Il peut sembler que

la condition de contrôle intégral peut être approchée, lorsque soit i) kED< < avec α un très petit positif

ou ii) kED< < kTrnl (ou kED· E< < gTrnl(R)). Dans le

dernier cas, pour que le niveau de protéine reste limité, il devrait y avoir un taux de dégradation de fond de la protéine indépendant de la concentration de cette protéine. Ce serait le cas si :

Au cours de la phase de croissance exponentielle des bactéries telles que E. moins de 1 % d'une protéine peut être dégradée au cours d'un cycle de division cellulaire [37]. Par conséquent, le terme majeur dans la dégradation des protéines est le terme de dilution et ce terme est généralement très petit. En effet, par définition, eμ⋅T= 2, oùT est le temps de doublement de la bactérie et alors μ= ln2/T. Pratiquement, la plus petite valeur

pour T est proche de 20 minutes [38], ce qui correspond au taux de croissance le plus rapide de E. coli :

ln 2=ð2060Þ ¼5:810−4 s−1 ð31Þ

Un tel taux de croissance chez les microbes tels que E. coli et la levure, qui est rapide pour les organismes mais lent à l'échelle de temps de la synthèse de l'ARN et des protéines, produit une faible constante de vitesse de dégradation efficace pour les protéines. Ci-dessous, nous verrons si une constante de vitesse de dégradation aussi faible suffit à produire un comportement d'adaptation presque parfait dans la pratique, ce qui serait interprété comme un système de contrôle intégral quasi-parfait.

Dans cette section, les scénarios de contrôle intégral et non intégral sont simulés sur la base de l'exemple donné sur la Figure 10 avec tous les paramètres cinétiques donnés dans [5]. Trois systèmes différents sont considérés, aveckED= 0, 0,2 et 0,4,

respectivement. Les trois systèmes sont simulés à partir de la même condition initiale. Les changements de concentration de l'ARNm, E et x3 sont présentés sur la figure 12. Après une période de temps (par ex.

30 secondes) les trois systèmes atteignent des états stables différents. Ensuite, à 50 secondes, nous perturbons un paramètre du système (c'est-à-dire le kcat de la troisième réaction) de 20% pour les trois cas.

Après un certain temps, les trois systèmes atteignent de nouveaux états stables. Après perturbation, seul le système avec dégradation des protéines d'ordre zéro (c'est-à-dire kED = 0), revient au même état stable

valeurs pour l'ARNm et x3 comme celles avant perturbation,

ce qui indique une parfaite adaptation : c'est un système de contrôle intégral idéal. Dans ce cas, la variable manipulée, le niveau enzymatique E, varie fortement. Son adaptation permet à x3 et à l'ARNm d'être totalement robustes vis-à-vis du

Figure 11Structure du système de contrôle d'un problème de contrôle pseudo-intégral ou intégral idéal. hTrsc(·) désigne le processus de transcription.

gTrnl(·) désigne le taux de synthèse des protéines. Le système de contrôle pseudo-intégral ne devient un contrôle intégral idéal que lorsque la ligne pointillée

perturbations du kcat de la troisième réaction. Dans l'autre

deux cas (c.-à-d.kED = 0,2 ou 0,4), le changement du niveau d'enzyme

est plus petit, mais les nouvelles valeurs à l'état d'équilibre de l'ARNm et de x3 s'écartent de leurs valeurs à l'état d'équilibre précédentes et

l'adaptation n'est pas parfaite. Cependant, les écarts ne sont pas importants, seulement 3% pour x3 et 4% pour l'ARNm lorsque kED = 0,2,

et 4 % pour x3 et 8 % pour l'ARNm quandkED = 0,4.

Considérons maintenant le scénario de suivi de référence. Les réponses de l'enzyme et de l'ARNm à une perturbation de 20 % de la stabilité de la protéine (r) à t = 50 secondes sont présentées sur la figure 13 pour trois constantes de vitesse différentes de dégradation de l'enzymekED. Seulement quand kED= 0 l'ARNm

la concentration a suivi la valeur de référence avec une « déviation » nulle en régime permanent. Ceci indique l'existence d'une action intégrale parfaite du système de régulation par rétroaction. Lorsque kED n'était pas égal à zéro (c'est-à-dire kED= 0,2 orkED=

0.4), la réponse de l'ARNm n'a pas suivi le signal de référence, indiquant que dans ces deux cas, le contrôleur du système n'était pas un contrôleur intégral idéal, bien qu'il ait moins changé que le signal de référence.

HCA et une interprétation hiérarchique offre-demande Cet exemple de simulation peut être représenté par une structure hiérarchique offre-demande comme dans la figure 4. Pour obtenir un contrôle intégral idéal, la synthèse et la dégradation des protéines doivent être indépendantes de la concentration de la protéine. qui se dégrade (c'est-à-dire

E gTrnlÞR). Puisque cela implique que la dégradation des protéines est d'ordre zéro dans la concentration en protéines :

De sorte que le coefficient de contrôle hiérarchique de la concentration en métabolites devient


Remerciements

Nous remercions Uri Gophna, Stephen G. Oliver et Tomer Shlomi pour leurs commentaires utiles sur le manuscrit. Nous remercions également François Delmotte pour son aide précieuse dans le processus de collecte des données. K.Y est partiellement soutenu par une bourse du programme de bioinformatique Edmond J. Safra de l'Université de Tel-Aviv. T.T. est boursier Koshland à l'Institut des sciences Weizmann et est soutenu par une bourse de voyage de la subvention de l'UE PIRG04-GA-2008-239317. B.P. est soutenu par l'International Human Frontier Science Program Organization, le Fonds hongrois pour la recherche scientifique (OTKA PD 75261) et le « Lendület Program » de l'Académie hongroise des sciences. La recherche d'ER est financée par des subventions de la Fondation James S. McDonnell, du consortium EU Microme et de la Fondation israélienne pour la science (ISF).

Contributions d'auteur: KY, TT, BP et ER ont conçu et conçu la recherche. KY, TT, BP et ER ont rédigé l'article. KY a effectué l'analyse et les calculs statistiques. TT a effectué la reconstruction phylogénétique.


Voir la vidéo: Chapitre 6 - 1ère Partie: Le système endocrinien - Cours de Biologie du DAEU-B (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Bean

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